七葉皂苷與曲安奈德合用對(duì)血-視網(wǎng)膜屏障損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制.pdf

1、研究背景:
　　 血-視網(wǎng)膜屏障（blood-retinal barrier，BRB）包括由視網(wǎng)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞及其緊密連接構(gòu)成的內(nèi)屏障，和由視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞及其緊密連接構(gòu)成的外屏障。正常情況下視網(wǎng)膜內(nèi)屏障可阻止血管內(nèi)液體和大分子物質(zhì)滲漏到視網(wǎng)膜;外屏障則阻止脈絡(luò)膜毛細(xì)血管血液滲漏到視網(wǎng)膜。各種原因，如缺血、糖代謝異常、炎性細(xì)胞因子的釋放、玻璃體以及視網(wǎng)膜前膜的機(jī)械牽引等都可以造成血-視網(wǎng)膜屏障的破壞，血管內(nèi)液體及大分子物質(zhì)

2、滲漏到細(xì)胞外間隙，形成視網(wǎng)膜水腫，發(fā)生于黃斑區(qū)的水腫稱(chēng)為黃斑水腫。黃斑水腫直接引起患者視力下降，如果長(zhǎng)期得不到緩解，可造成視網(wǎng)膜組織不可逆性損傷終致失明。因此，黃斑水腫的早期治療十分重要。
　　 黃斑水腫目前常用的治療方法包括:①激光治療，一定程度上緩解黃斑水腫，但對(duì)于彌漫性黃斑水腫患者則療效欠佳，甚至部分患者在治療后黃斑水腫加重;②玻璃體內(nèi)注射糖皮質(zhì)激素(如曲安奈德triamcinolone acetonide，TA)、抗血管

3、內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)抗體（如雷珠單抗）等取得了較好療效，但藥物半衰期短，需反復(fù)多次注射，增加了玻璃體內(nèi)感染的幾率，以及眼內(nèi)壓升高和白內(nèi)障發(fā)生的幾率（發(fā)生幾率高達(dá)30％-50％）。
　　 研究表明，由occludin、claudin-5、與zonula occludens-1等蛋白構(gòu)成的細(xì)胞間緊密連接是維持血-視網(wǎng)膜屏障生理功能的重要保障。糖皮質(zhì)激素在體內(nèi)外

4、能與糖皮質(zhì)激素受體結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞間緊密連接蛋白的表達(dá)進(jìn)而降低受損血-視網(wǎng)膜屏障的通透性，這可能是糖皮質(zhì)激素治療黃斑水腫的機(jī)制之一。
　　 七葉皂苷是中藥娑羅子的主要成分，具有穩(wěn)定血管內(nèi)皮細(xì)胞、保護(hù)血腦屏障和增加靜脈張力等作用，臨床常用于治療創(chuàng)傷及各種手術(shù)后水腫、視網(wǎng)膜靜脈阻塞以及中心性滲出性脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜炎等。前期研究顯示，七葉皂苷可上調(diào)糖皮質(zhì)激素受體的表達(dá)，抑制炎癥相關(guān)因子，在抗炎作用方面與糖皮質(zhì)激素具有顯著協(xié)同效應(yīng)，但無(wú)免疫抑

5、制作用。由此我們推測(cè)，七葉皂苷有可能通過(guò)提高糖皮質(zhì)激素受體的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)糖皮質(zhì)激素對(duì)血-視網(wǎng)膜屏障的保護(hù)作用（協(xié)同保護(hù)作用）。如果假設(shè)成立，可為黃斑水腫的治療提供新的思路，降低糖皮質(zhì)激素的使用劑量，減少其產(chǎn)生的不良反應(yīng)。
　　 研究目的:
　　 基于玻璃體內(nèi)注射糖皮質(zhì)激素治療黃斑水腫易導(dǎo)致眼內(nèi)感染、白內(nèi)障及眼內(nèi)壓升高等的現(xiàn)狀，本研究擬探討七葉皂苷(escin)與曲安奈德聯(lián)合應(yīng)用對(duì)血-視網(wǎng)膜屏障損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制，為

6、降低糖皮質(zhì)激素的使用劑量、減少其不良反應(yīng)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 研究方法:
　　 本研究分為兩部分:第一部分為體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，研究七葉皂苷與曲安奈德聯(lián)合應(yīng)用對(duì)急性高眼壓導(dǎo)致的大鼠血-視網(wǎng)膜屏障損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制;第二部分為體外實(shí)驗(yàn)，研究七葉皂苷與曲安奈德聯(lián)合應(yīng)用對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（humanumbilical vein endothelial cells，HUVECs）及視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞-19(retinalpigment

7、 epithelium cells-19，ARPE-19)緊密連接的影響及其機(jī)制。
　　 1.七葉皂苷與曲安奈德聯(lián)合應(yīng)用對(duì)急性高眼壓導(dǎo)致的大鼠血-視網(wǎng)膜屏障損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制。
　　 首先通過(guò)大鼠眼前房灌注乳酸鈉林格氏液升高眼內(nèi)壓制備缺血-再灌注模型造成血-視網(wǎng)膜屏障損傷。然后將模型大鼠隨機(jī)分為模型組、七葉皂苷小劑量組（0.9 mg/kg）、七葉皂苷大劑量組（1.8 mg/kg）、曲安奈德小劑量組(2μl,40mg/

8、ml)、曲安奈德大劑量組(5μl,40 mg/ml)以及小劑量七葉皂苷和曲安奈德聯(lián)合用藥組，外加一假手術(shù)組作為對(duì)照。造模結(jié)束后立即給藥，其中七葉皂苷尾靜脈注射給藥，曲安奈德玻璃體內(nèi)注射給藥。假手術(shù)組大鼠麻醉后，僅眼前房插針注入乳酸鈉林格氏液維持正常眼壓，維持時(shí)間與大鼠急性高眼壓模型前后總時(shí)間一致，不做藥物治療。給藥后24 h，隨機(jī)取6只大鼠6只眼睛，用尾靜脈注射伊文思藍(lán)(45 mg/kg)的方法定量檢測(cè)藥物對(duì)血-視網(wǎng)膜屏障通透性的影響，

9、同時(shí)取鼠眼，甲醛固定，H-E染色，用Metamorph/BX51圖像分析軟件測(cè)量視網(wǎng)膜厚度。
　　 進(jìn)一步通過(guò)免疫組化及Western blot技術(shù)檢測(cè)七葉皂苷與曲安奈德合用對(duì)血-視網(wǎng)膜屏障損傷大鼠緊密連接蛋白o(hù)ccludin表達(dá)的影響。
　　 2.七葉皂苷與曲安奈德聯(lián)合應(yīng)用對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞-19緊密連接的影響及其機(jī)制。
　　 首先在Transwell24孔培養(yǎng)板接種人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和視網(wǎng)膜

10、色素上皮細(xì)胞-19，用含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，通過(guò)細(xì)胞電阻儀定期檢測(cè)電阻，判斷細(xì)胞間緊密連接的形成情況。細(xì)胞緊密連接建立后，加入重組人VEGF2μl（終濃度:視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞-1910 ng/ml;人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞100 ng/ml）破壞緊密連接，同時(shí)分別給予七葉皂苷(終濃度0.1、1、10μg/ml)、曲安奈德(0.01、0.1、1μmol/L)以及七葉皂苷（0.1μg/ml）+曲安奈德(0.01μmol/L)，每個(gè)濃

11、度設(shè)3個(gè)平行孔，另設(shè)3孔（不加VEGF和藥物）作為空白對(duì)照，再另設(shè)3孔（只加VEGF不加藥物）作模型對(duì)照孔。加藥完成后，振蕩混勻，置于CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，分別在不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)電阻，判斷藥物對(duì)細(xì)胞間緊密連接的影響。
　　 進(jìn)一步在體外細(xì)胞屏障模型，通過(guò)Western blot技術(shù)檢測(cè)七葉皂苷與曲安奈德合用對(duì)細(xì)胞緊密連接蛋白o(hù)ccludin、zonula occludens-1(ZO-1)以及糖皮質(zhì)激素受體表達(dá)的影響。
　

12、　 研究結(jié)果:
　　 1.七葉皂苷與曲安奈德聯(lián)合應(yīng)用對(duì)急性高眼壓導(dǎo)致的大鼠血-視網(wǎng)膜屏障損傷的保護(hù)作用。
　　 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血-視網(wǎng)膜屏障通透性及視網(wǎng)膜厚度顯著增加(p＜0.01)。與模型組比較，高劑量七葉皂苷(1.8 mg/kg)與曲安奈德(5μl)均能顯著抑制大鼠血-視網(wǎng)膜屏障通透性(p＜0.05，p＜0.01)及減輕視網(wǎng)膜厚度(均為p＜0.05)，而低劑量七葉皂苷(0.9 mg/kg)與曲安奈德（2

13、μl）對(duì)大鼠血-視網(wǎng)膜屏障通透性和厚度未見(jiàn)顯著影響（均為p＞0.05）。
　　 進(jìn)一步將單用無(wú)顯著效果的七葉皂苷（0.9 mg/kg）與曲安奈德(2μl)聯(lián)合應(yīng)用，結(jié)果對(duì)模型大鼠血-視網(wǎng)膜屏障通透性及水腫視網(wǎng)膜厚度有顯著抑制作用(p＜0.05)，顯示出協(xié)同作用。
　　 2.七葉皂苷與曲安奈德聯(lián)合應(yīng)用對(duì)血-視網(wǎng)膜屏障損傷大鼠緊密連接蛋白o(hù)ccludin表達(dá)的影響。
　　 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠視網(wǎng)膜occlud

14、in蛋白表達(dá)顯著減少(p＜0.01）。與模型組比較，單獨(dú)使用七葉皂苷（0.9 mg/kg）與曲安奈德(2μl)對(duì)大鼠視網(wǎng)膜occludin蛋白表達(dá)未見(jiàn)顯著影響，將七葉皂苷(0.9 mg/kg)與曲安奈德(2μl)聯(lián)合應(yīng)用，免疫組化和Western blot結(jié)果顯示神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層occludin蛋白表達(dá)顯著增加(p＜0.05)，顯示出協(xié)同作用。
　　 3.七葉皂苷與曲安奈德聯(lián)合應(yīng)用對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞-19緊密連接

15、電阻的影響。
　　 與空白對(duì)照組比較，VEGF能顯著降低人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞-19緊密連接的電阻(p＜0.05)。與模型對(duì)照組(VEGF)比較，七葉皂苷(1、10μg/ml)與曲安奈德(0.1、1μmol/L)均能顯著增加人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞-19緊密連接的電阻(p＜0.05和p＜0.01），而七葉皂苷(0.1μg/ml)與曲安奈德(0.01μmol/L)對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞-1

16、9緊密連接的電阻未見(jiàn)顯著影響。
　　 進(jìn)一步將單用無(wú)顯著效果的七葉皂苷(0.1μg/ml)與曲安奈德(0.01μmol/L)聯(lián)合應(yīng)用，結(jié)果顯示能顯著增大細(xì)胞緊密連接電阻(p＜0.05)，顯示出協(xié)同作用。
　　 4.七葉皂苷與曲安奈德聯(lián)合應(yīng)用對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接蛋白o(hù)ccludin、ZO-1表達(dá)的影響。
　　 與空白對(duì)照組比較，VEGF能顯著抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接蛋白的表達(dá)(p＜0.05)。與模型對(duì)照組

17、(VEGF)比較，七葉皂苷(0.1μg/ml)與曲安奈德(0.01μmol/L)對(duì)細(xì)胞緊密連接蛋白表達(dá)未見(jiàn)顯著影響，但七葉皂苷(0.1μg/ml)與曲安奈德(0.01μmol/L)聯(lián)合應(yīng)用，結(jié)果能顯著提高人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接蛋白的表達(dá)(p＜0.05)，顯示出協(xié)同作用。
　　 5.七葉皂苷與曲安奈德聯(lián)合應(yīng)用對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞糖皮質(zhì)激素受體表達(dá)的影響。
　　 與模型對(duì)照組(VEGF)比較，七葉皂苷（0.1μg/ml）與曲

18、安奈德(0.01μmol/L)單獨(dú)用對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞糖皮質(zhì)激素受體蛋白表達(dá)未見(jiàn)顯著影響，但將七葉皂苷(0.1μg/ml)與曲安奈德(0.01μmol/L)聯(lián)合應(yīng)用，結(jié)果能顯著提高人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞糖皮質(zhì)激素受體蛋白的表達(dá)(p＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1.在缺血再灌注引起的視網(wǎng)膜水腫大鼠，小劑量七葉皂苷與小劑量曲安奈德單獨(dú)使用對(duì)大鼠血-視網(wǎng)膜屏障通透性和水腫視網(wǎng)膜厚度沒(méi)有顯著影響;但當(dāng)二者聯(lián)合應(yīng)用時(shí)則對(duì)大鼠血-視

19、網(wǎng)膜屏障通透性有顯著抑制作用，顯示出明顯的協(xié)同作用。七葉皂苷可通過(guò)放大糖皮質(zhì)激素的生物效應(yīng)提示可減少糖皮質(zhì)激素的用量。
　　 2.七葉皂苷與曲安奈德聯(lián)合應(yīng)用對(duì)血-視網(wǎng)膜屏障損傷的保護(hù)具有協(xié)同作用，其機(jī)制與提高糖皮質(zhì)激素受體表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)緊密連接蛋白o(hù)ccludin、ZO-1表達(dá)有關(guān)。
　　 3.在大鼠高眼壓造成缺血再灌注模型，靜脈注射大劑量七葉皂苷能顯著抑制大鼠血-視網(wǎng)膜屏障通透性增加，減輕缺血導(dǎo)致的水腫視網(wǎng)膜厚度。在體