IL-13對(duì)與人乳腺癌細(xì)胞共培養(yǎng)的人乳腺成纖維細(xì)胞自噬基因Beclin1和LC3II表達(dá)的影響.pdf

1、目的:癌相關(guān)成纖維細(xì)胞（carcinoma-associated-fibroblasts，CAFs）是一種近來(lái)被廣泛關(guān)注的基質(zhì)細(xì)胞。作為腫瘤基質(zhì)的最主要成分，它通過(guò)不斷地向其所處外界環(huán)境分泌大量細(xì)胞因子等物質(zhì)，直接或間接作用于其周圍的腫瘤細(xì)胞。這不僅促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的不斷增殖，而且加速腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移。有證據(jù)顯示，癌相關(guān)成纖維細(xì)胞通過(guò)高程度自噬行為降解自身大分子并分泌養(yǎng)分于外界環(huán)境中，為其所處微環(huán)境中的癌細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)。白細(xì)胞介素13(I

2、nterlukine13，IL-13)是Th2細(xì)胞分泌的多效能細(xì)胞因子，它在乳腺腫瘤與乳腺炎都有異常高的表達(dá)。近期研究顯示，IL-13參與調(diào)控成纖維細(xì)胞亞型細(xì)胞的NF-κB(nuclear transcription factorκB)，通路的上游信號(hào)，而NF-κB則是參與細(xì)胞自噬調(diào)控過(guò)程的重要信號(hào)分子。本研究通過(guò)將人乳腺成纖維細(xì)胞與人乳腺癌細(xì)胞共培養(yǎng)模擬腫瘤微環(huán)境，力圖探索IL-13在腫瘤微環(huán)境中對(duì)人乳腺成纖維細(xì)胞的增殖和自噬基因表達(dá)

3、的影響。
　　方法:1.細(xì)胞培養(yǎng):細(xì)胞生長(zhǎng)在含10％胎牛血清、105U/L青霉素和105U/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，放入37℃、5％CO2、100％相對(duì)濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。2.實(shí)驗(yàn)分組:實(shí)驗(yàn)分為4組，空白組（單獨(dú)培養(yǎng)人乳腺成纖維細(xì)胞株Hs578Bst）;IL-13組（單獨(dú)培養(yǎng)人乳腺成纖維細(xì)胞株Hs578Bst并加入終濃度20ng/mL IL-13）;共培養(yǎng)組又稱435組（人乳腺成纖維細(xì)胞株Hs578Bst與人乳腺癌細(xì)胞株MDA-

4、MB-435共培養(yǎng)）;共刺激組（人乳成纖維細(xì)胞株Hs578Bst與人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-435懸掛共培養(yǎng)并加入終濃度20ng/mL IL-13）。3.臺(tái)盼藍(lán)染色:臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)各組Hs578Bst細(xì)胞的活性。4.CCK-8法:將105/mL的Hs578Bst細(xì)胞接入6孔板，參照分組分別加入終濃度20ng/mL IL-13，或以4∶1的比例將Hs578Bst細(xì)胞與MDA-MB-435細(xì)胞共培養(yǎng)。培養(yǎng)72h后，CCK-8法測(cè)定各組Hs

5、578Bst細(xì)胞的增殖。5.免疫細(xì)胞化學(xué)法:各組細(xì)胞培養(yǎng)72h后，免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)Hs578Bst細(xì)胞自噬分子Beclin1及LC3Ⅱ的蛋白表達(dá)，IPP6軟件測(cè)各組兩種自噬相關(guān)蛋白的平均光密度。6.實(shí)時(shí)定量熒光PCR:各組細(xì)胞培養(yǎng)72h后，用實(shí)時(shí)定量熒光PCR檢測(cè)Hs578Bst細(xì)胞自噬分子Beclin1和LC3Ⅱ的mRNA的表達(dá)。
　　結(jié)果:1.細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，IL-13對(duì)Hs578Bst細(xì)胞的活細(xì)胞百分率無(wú)顯著影響。

6、2.細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，435組分別與空白組或IL-13組比較，435組細(xì)胞數(shù)量增加(P＜0.05);共刺激組分別與空白組或IL-13組比較，共刺激組細(xì)胞數(shù)量增加(P＜0.05);空白組與IL-13組之間無(wú)顯著差異(P＞0.05);435組與共刺激組之間無(wú)顯著差異(P＞0.05)。3.免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，共刺激組分別與各組比較，Hs578Bst細(xì)胞的Beclin1和LC3Ⅱ蛋白表達(dá)均顯著上調(diào)(P＜0.05);435組Hs578B

7、st細(xì)胞Beclin1和LC3Ⅱ蛋白均表達(dá)上調(diào)，分別與空白組或IL-13組比較，差異有顯著性(P＜0.05)。IL-13組與空白組比較，Hs578Bst細(xì)胞的Beclin1和LC3Ⅱ蛋白表達(dá)均無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。4.實(shí)時(shí)定量熒光PCR結(jié)果顯示，共刺激組分別與各組比較，Hs578Bst細(xì)胞的Beclin1與LC3Ⅱ的mRNA表達(dá)均顯著上調(diào)(P＜0.05)，435組Hs578Bst細(xì)胞的Beclin1與LC3Ⅱ的mRNA表達(dá)上調(diào)，

8、分別與空白組或IL-13組比較，差異有顯著性(P＜0.05)。IL-13組與空白組比較，Hs578Bst細(xì)胞Beclin1和LC3Ⅱ mRNA表達(dá)均無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。
　　結(jié)論:1.人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-435與人乳腺成纖維細(xì)胞株Hs578Bst共培養(yǎng)能促進(jìn)Hs578Bst細(xì)胞的增殖。2.IL-13對(duì)人乳腺成纖維細(xì)胞株Hs578Bst的增殖無(wú)顯著影響。3.IL-13與人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-435具有協(xié)同作用