冷血漿停搏液對幼兔缺血-再灌注損傷心肌保護(hù)機(jī)制的實驗研究.pdf

1、心肌持續(xù)性缺血可導(dǎo)致組織損傷和細(xì)胞死亡，盡管早期再灌注對組織非常重要，但再灌注后血液循環(huán)中白細(xì)胞附壁、聚積、滲出血管而浸潤心肌，導(dǎo)致心肌細(xì)胞壞死，加之補(bǔ)體激活以及活性氧的產(chǎn)生，致使缺血性心肌損傷更為嚴(yán)重，即缺血/再灌注損傷(MI/RI)。心臟直視手術(shù)時冠狀動脈血運(yùn)被阻斷，心肌處于缺血乏氧狀態(tài)；當(dāng)手術(shù)結(jié)束心肌恢復(fù)正常血運(yùn)時又導(dǎo)致心肌新的損傷--再灌注損傷。如何最大限度地減輕心肌MI/RI一直是心臟外科至關(guān)重要的課題。 近年來，未成

2、熟心肌保護(hù)已成為心肌保護(hù)研究的熱點(diǎn)之一。本研究采用幼兔離體缺血/再灌注心臟模型，通過檢測冠，脈流出液中CK-MB、LD1-LD2和ATP及心肌組織中MDA、SOD和GSH-PX的含量，心肌細(xì)胞中TNF蛋白、TNF mRNA和Bcl-2 mRNA表達(dá)的變化，以及心肌細(xì)胞凋亡情況，來探討冷血漿停搏液對未成熟心肌的保護(hù)作用和機(jī)制，為冷血漿停搏液對未成熟心肌保護(hù)的臨床研究提供實驗依據(jù)和理論基礎(chǔ)。 實驗材料: 1.實驗動物與分組1

3、4～26日齡新西蘭大耳白兔，體重350～580g，32只。隨機(jī)抽取4只作為正常對照組，余28只隨機(jī)均分為冷血漿(P)組和冷晶體(C)組。 2.主要儀器上海產(chǎn)恒溫水泵，德國產(chǎn)DIAX900勻漿機(jī)，德國產(chǎn)超聲粉碎機(jī)，DUPONT SUPER T-21型離心機(jī)，JUNG-CMl800型切片機(jī)，PTC-100PCR擴(kuò)增儀，KODAK ID型凝膠成像系統(tǒng)分析儀。 3.主要試劑 MDA、SOD和GSH-PX檢測試劑盒由南京建成生物工

4、程研究所提供；免疫組化試劑盒購自北京中山生物工程公司；原位雜交試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司;PCR檢測試劑盒購自TaKaRa公司；引物由北京奧科生物工程公司提供。 實驗方法: 1.離體心臟制備與標(biāo)本收集肌肉注射‘846'麻醉劑0.3ml/kg，耳緣靜脈注入肝素400u/kg抗凝，正中開胸摘取心臟，立即侵入4℃的鹽水中，主動脈插管，連接Langendorff灌注裝置，用37℃的K-H液灌注，灌注壓為60 cmH2O

5、(5.88kPa)，灌注10分鐘后收集10分鐘的冠脈流出液。正常對照組立即終止灌注，取右室心肌作檢測用。P組和C組降溫同時開始分別灌注冷血漿停搏液或冷晶體停搏液(4℃)20ml/kg，灌注壓為60 cmH2O(5.88kPa)。低溫(10℃)停搏30分鐘后，開始復(fù)溫并再灌注37℃K-H液，10分鐘后收集冠脈流出液，實驗結(jié)束時取右室心肌作檢測用。 2.冷血漿停搏液的制備清潔級健康成熟新西蘭大耳白兔，麻醉后解剖頸內(nèi)動脈，穿人20號套

6、管針放血，所收集血液經(jīng)沉淀法分離血漿，與St.Thomas停搏液按4:1比例配成血漿停搏液，加鉀至St.Thomas停搏液鉀濃度后冷藏備用。 3.檢測指標(biāo)及方法灌注停搏液至心臟機(jī)械停搏時間、心臟停搏前、后工作心的復(fù)跳時間、心率、冠脈流量、心肌含水量；用全自動生化檢測儀檢測冠脈流出液CK-MB和LD1/LD2含量；用高效液相色譜法檢測冠脈流出液.ATP含量；采用硫代巴比妥酸法、黃嘌呤氧化酶法和二硫代二硝基苯甲酸法分別檢測心肌組織中

7、MDA、SOD和GSH-PX；采用免疫組化、原位雜交、TUNEL法和RT-PCR方法分別檢測心肌組織中TNF蛋白、TNFmRNA和Bcl-2 rnRNA表達(dá)及細(xì)胞凋亡發(fā)生情況 4.統(tǒng)計學(xué)方法所有數(shù)據(jù)均采用-x±s表示，用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行t檢驗，P<0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。 實驗結(jié)果： 1.灌注冷血漿停搏液和冷晶體停搏液至心臟機(jī)械停搏時間分別為13.9±2.2秒和14.1±2.0秒，差異無顯著性(P>0

8、.05)。 2.P組復(fù)跳時間、心率、冠脈流量和心肌含水量分別為31-8±5.9秒、128.9±5.2 bpm、5.1±0.2 ml/min和72％±2％，C組為40.1±4.8秒、120.3±3.7 bpm、3.3±0.5 ml/min和77％±14％，差異顯著(P<0.05)。 3.P組冠脈流出液中CK-MB、LD1/LD2和ATP含量分別為55.64±7.27 IU/L、0.86±0.04和0.94±0.17 umo

9、l/L，C組分別為88.93±3.27 IU/L、1.10±0.10和1.71±0.34 umol/L，差異顯著(P<0.01或P<0.05)。 4.P組心肌MDA和GSH-PX含量分別為0.18±0.03 nmol/mgprot和27.34±3.03 NU/mgprot.C組分別為0.27±0.05 nmol/mgprot和16.74±1.12 NU/mgprot，差異均非常顯著(P<0.01)；P組心肌SOD含量為114.1

10、5±12.57 NU/mgprot，C組為104.01±13.87 NU/mgprot，差異不顯著(P>0.05)。 5.在無缺血/再灌注的未成熟心肌組織中沒有TNF蛋白和TNF mRNA表達(dá)，染色呈陰性；但是，在經(jīng)歷缺血/再灌注的實驗組，心肌組織中TNF蛋白和TNF mRNA表達(dá)明顯，P組染色呈弱陽性或陽性，而C組呈強(qiáng)陽性或陽性。 6.在元缺血/再灌注的對照組心肌組織中沒有看到凋亡細(xì)胞；在經(jīng)歷缺血/再灌注的實驗組，出現(xiàn)

11、少量心肌細(xì)胞凋亡。 7.缺血/再灌注損傷可以使心肌組織中Bcl-2 mRNA表達(dá)減弱；對照組心肌組織中Bcl-2 mRNA相對含量為0.921±0.015，P組為0.712±0.021，C組為0.504±0.028，差異顯著(P<0.01或P<0.05)。 討論: 1.冷血漿停搏液對幼兔心肌保護(hù)的可行性目前國內(nèi)外學(xué)者對未成熟心肌保護(hù)的研究并不多，一些學(xué)者認(rèn)為，單純低溫對未成熟心肌的保護(hù)可獲得良好的效果；但相當(dāng)一部

12、分學(xué)者認(rèn)為，為了減少心肌能量消耗，應(yīng)使心肌快速停跳于舒張期。對未成熟心肌保護(hù)也應(yīng)該用停搏液。 2.冷血漿停搏液對幼兔心肌酶和能量代謝的影響未成熟心肌高能磷酸化酶缺乏，高能磷酸鹽含量高，糖原分解和無氧酵解能力強(qiáng)，更多地依賴葡萄糖或糖原的有氧分解和無氧酵解供給能量。 心肌缺血/再灌注損傷可出現(xiàn)細(xì)胞膜通透性與膜完整性的改變，再灌注后心肌酶的大量漏出即為這種改變的表現(xiàn)之一。急性心肌梗死時CK-MB陽性檢出率達(dá)100％，特異性為9

13、2％～100％。冷血漿停搏液對未成熟心肌保護(hù)的機(jī)制是通過其提供豐富的能量底物，較強(qiáng)的酸堿緩沖能力，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，對抗缺血/再灌注對未成熟心肌的損傷。 3.冷血漿停搏液對氧自由基的影響MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物。因此，MDA不僅反映脂質(zhì)過氧化程度，也間接反映OFR生成量和心肌細(xì)胞損傷程度。GSH-PX在細(xì)胞內(nèi)能清除有害的過氧化物代謝產(chǎn)物，阻斷脂質(zhì)過氧化鏈鎖反應(yīng)。 冷血漿停搏液可使離體缺血/再灌注幼兔心肌組織中M

14、DA含量下降，SOD和GSH-PX含量增高，阻斷脂質(zhì)過氧化鏈鎖反應(yīng)，維持了細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性，實現(xiàn)其心肌保護(hù)的作用。其機(jī)制為冷血漿停搏液可促使K+通道開放，細(xì)胞膜超極化，從而抑制了Ca2+的內(nèi)流，其結(jié)果減少了Ca2+對蛋白酶和磷脂酶的激活。 4.冷血漿停搏液對缺血/再灌注介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響近年來的研究證明，缺血/再灌注損傷是一種肯定的、機(jī)制復(fù)雜的病理改變過程，其中包括氧自由基損傷、ATP酶水解、Ca2+超載和細(xì)胞凋亡等。199

15、4年Gottlieb首先在兔心臟上發(fā)現(xiàn)再灌注損傷促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡發(fā)生。在心肌缺血/再灌注損傷中，細(xì)胞死亡的形式除了壞死外，還有凋亡(主要發(fā)生在再灌注期間，發(fā)生機(jī)制與Ca2+超載有關(guān))，且凋亡是心肌缺血/再灌注損傷的重要組成部分。 TNF和Bcl-2是心肌缺血/再灌注損傷時發(fā)生細(xì)胞凋亡中重要影響因素。抑制和阻斷TNF受體信號傳導(dǎo)的瀑布式激活作用和增強(qiáng)Bcl-2基因表達(dá)是防止或減少心臟缺血后細(xì)胞凋亡的重要途徑，在預(yù)防和減輕心肌缺血/

16、再灌注損傷中具有重要的意義。 本研究結(jié)果表明：在無缺血/再灌注的正常未成熟心肌組織中沒有TNFmRNA和TNF蛋白表達(dá)，在經(jīng)歷缺血/再灌注的實驗組心肌組織中TNFmRNA和TNF蛋白表達(dá)陽性，提示即使在無血液循環(huán)存在的情況下，缺血/再灌注也可以激發(fā)心肌細(xì)胞產(chǎn)生TNF。原位雜交和免疫組化的研究將TNF表達(dá)主要定位于心肌細(xì)胞，說明心肌細(xì)胞是影響心肌功能的TNF的重要來源。冷血漿停搏液可抑制TNF在心肌細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，其機(jī)制可能是通過其

17、抗氧化作用減少氧自由基的產(chǎn)生或抑制氧自由基活性，降低了氧自由基對F38促有絲分裂蛋白激酶和核因子Kappa B(Nuclear factor KB，NFKB)的激活作用，從而減少了心肌TNF的產(chǎn)生。 本研究的結(jié)果對缺血/再灌注未成熟心肌保護(hù)具有重要的臨床指導(dǎo)意義。本研究采用的模型可以為在實驗室對未成熟心肌保護(hù)機(jī)制進(jìn)行研究和檢驗有效的預(yù)防和治療方案提供一個便捷的途徑。 結(jié)論: 1.冷血漿停搏液具有使幼兔心臟快速停

18、搏于舒張期的作用。 2.與冷晶體停搏液相比冷血漿停搏液可明顯提高幼兔心率及冠脈流量的恢復(fù)率，減輕心肌水腫。 3.冷血漿停搏液可使幼兔缺血/再灌注心肌酶和ATP漏出減少。 4.冷血漿停搏液可使幼兔缺血/再灌注心肌組織OFR生成減少，抗氧化能力增強(qiáng)。 5.在缺血/再灌注過程中，冷血漿停搏液能抑制TNF蛋白和TNF mR-NA在心肌內(nèi)的表達(dá)，上調(diào)Bcl-2 mRNA在心肌內(nèi)的表達(dá)，從而抑制或延緩未成熟心肌細(xì)胞凋