短鏈神經(jīng)毒素SN285兩個特異位點對活性的影響及機制分析.pdf

1、　　在青環(huán)海蛇毒腺cDNA文庫中發(fā)現(xiàn)一段編碼短鏈神經(jīng)毒素的基因，其編碼的毒素SN285具有獨特的序列，缺少在其他α-神經(jīng)毒素中高度保守的功能性殘基Asp31、Arg33(Ea序列)，在其同源位置上分別為Gly29、His31，為了解這兩個位點上非保守性氨基酸取代對毒素功能與活性的可能影響，本論文利用定點突變將這兩個位點分別或同時突變成為原來保守的殘基，突變體分別命名為：rMuD、rMuR、rMuDR?！　±帽緦嶒炇覙?gòu)建的原核融合表達

2、載體pTRX成功構(gòu)建了三個毒素突變體的重組表達載體，含T7啟動子、目的基因上游為硫氧還蛋白TRX的編碼序列，融合伴體與目的蛋白間含6×His純化標簽及蛋白酶切割位點。　　利用鎳離子螯合層析、蛋白酶PreScissionprotease切割、陽離子交換層析、凝膠過濾層析進行幾步簡便高效的純化，最后得到電泳純的三種毒素突變體?！　±么笫箅跎窠?jīng)-膈肌標本檢測rSN285及三個毒素突變體的組織活性，以rSN311為陽性對照，五種毒素或突變

3、體均能阻斷神經(jīng)傳導、抑制膈肌對刺激神經(jīng)引起的收縮反應(yīng)，但相互間的活性有明顯差異，對神經(jīng)傳導的阻斷活性依次為：rSN285＞rMuDR、rSN311＞rMuR＞rMuD，除rMuD作用濃度為2μm，其余毒素作用濃度均為1μM，在完全阻斷神經(jīng)傳導后，rSN285及三個毒素突變體與受體解離的能力與程度有明顯差異，從受體解離的能力依次為：rMuD＞rSN285＞rMuR＞rMuDR。　　以急性分離的大鼠背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元為標本、采用全細胞膜片鉗