葛根芩連湯配伍毒效及主要成份譜藥動(dòng)學(xué)變化的研究.pdf

1、目的: 通過(guò)觀察葛根芩連湯拆方后含黃連各配伍組對(duì)葡萄糖-6磷酸脫氫酶（G6PD）缺陷的痢疾桿菌感染（BD）大鼠模型（G6PD-BD）紅細(xì)胞滲透脆性的影響，探討黃連配伍對(duì)降低紅細(xì)胞脆性影響的原因，通過(guò)大鼠糞便狀態(tài)的改變比較各配伍組的療效；通過(guò)觀察分別灌服葛根芩連湯和黃連大鼠肝臟和腎臟病理切片，考察葛根芩連湯配伍對(duì)肝腎毒性的影響；采用高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測(cè)定葛根、黃連及葛根芩連湯中主要成分犬血中濃度，計(jì)算其藥動(dòng)參數(shù)，探索配伍對(duì)主

2、要成分體內(nèi)過(guò)程的影響。綜合分析、探討葛根芩連湯的配伍規(guī)律。 1．建立動(dòng)物模型：先用痢疾桿菌感染大鼠，第二天用乙酰苯肼造成G6PD缺陷，建立實(shí)驗(yàn)性G6PD-BD大鼠模型。 2．隱血實(shí)驗(yàn)：用含黃連的葛根芩連湯各拆方組水煎液給G6PD-BD大鼠灌胃，每天兩次，連續(xù)三天，每天觀察糞便狀態(tài)，第四天腹主動(dòng)脈取血，測(cè)定其始溶血鹽濃度。 3．病理實(shí)驗(yàn)：分別給正常大鼠和G6PD-BD大鼠灌胃高中低劑量的黃連和葛根芩連湯水煎液，每天

3、兩次，連續(xù)三天，第四天麻醉后取其肝臟和腎臟，做病理切片，觀察病理結(jié)果。 4．藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)：建立葛根和黃連主要成分的高效液相色譜質(zhì)譜檢測(cè)方法，測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)主要成分血清中含量，WinNonlin藥動(dòng)學(xué)軟件計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。 按處方配比取葛根芩連湯各味藥（葛根24g，黃芩9g，黃連9g，甘草6g）5倍處方量，分別加水2400ml，浸泡15min，先煎葛根20min，余藥共煎30min，煎二次，趁熱用120目濾布濾過(guò)，合并濾液，濃

4、縮至360mL，備用。黃連、葛根水煎液同上處理。 分別給不同比格犬葛根、黃連單煎液和葛根芩連湯，不同時(shí)間點(diǎn)股靜脈取血，血樣離心（3000r/min）20min，取上清液，乙腈沉淀雜質(zhì)，渦旋混合器上震蕩5min，離心（3000r/min）20min，取上清液氮?dú)鈸]干溶劑，甲醇定容1ml，0．22μm濾膜過(guò)濾，得樣品溶液。采用高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀器（HPLC-MSn）進(jìn)行分析，色譜柱Zorbax Eclipse XDB-C18（4

5、．6×100mm，1．8um）：流動(dòng)相A0．02mol/L的醋酸銨水溶液，B為乙腈，梯度洗脫，對(duì)葛根主要成分進(jìn)行含量測(cè)定；流動(dòng)相A0．2%三乙胺的水溶液（調(diào)pH值為6），B為乙腈，梯度洗脫，對(duì)黃連主要成分進(jìn)行含量測(cè)定。 結(jié)果: 1．G6PD-BD大鼠具有體青、體涼，便黑，立毛現(xiàn)象，大便量多、稀、出現(xiàn)白膜，結(jié)果顯示造模成功。 2．隱血實(shí)驗(yàn)表明，單味黃連能使G6PD-BD大鼠紅細(xì)胞滲透脆性增加，黃連配伍葛根、黃芩、炙

6、甘草后均能降低紅細(xì)胞滲透脆性，其中葛根芩連湯全方和黃連、黃芩、葛根配伍組能使紅細(xì)胞滲透脆性恢復(fù)到正常水平。通過(guò)對(duì)大鼠糞便狀態(tài)的觀察發(fā)現(xiàn)給予葛根芩連湯、黃連葛根甘草、黃連葛根的大鼠第二天糞便恢復(fù)正常狀態(tài)，給予其他配伍組的大鼠第三天才恢復(fù)正常狀態(tài)。 3．分別給G6PD-BD大鼠和正常大鼠高、中、低劑量的單味黃連和葛根芩連湯全方，比較其肝臟腎臟病理切片，模型組給藥后腎臟充血比較：高劑量黃連>中劑量黃連=低劑量黃連，高劑量葛根芩連湯>中

7、劑量葛根芩連湯=低劑量葛根芩連湯；正常組給藥后腎臟充血情況比較：高劑量黃連>中劑量黃連>低劑量黃連。模型組和正常組給藥肝臟充血情況比較：高劑量黃連=中劑量黃連>低劑量黃連；模型組給藥肝臟水腫情況比較：高劑量黃連>中劑量黃連≥低劑量黃連，高劑量葛根芩連湯>中劑量葛根芩連湯=低劑量葛根芩連湯；正常組給藥肝臟水腫情況比較：高劑量黃連>中劑量黃連≥低劑量黃連，中劑量葛根芩連湯>低劑量葛根芩連湯>高劑量葛根芩連湯。 4．主要成分采用藥動(dòng)學(xué)

8、WinNonlin軟件處理后結(jié)果如下： （1）葛根芩連湯與單味葛根中主要成分藥動(dòng)參數(shù)變化對(duì)比： ①葛根素：AUC比葛根大，CL比葛根慢，t1/2較葛根快，Tmax較葛根慢，Cmax較葛根高；②大豆苷：AUC比葛根大，CL比葛根快，t1/2較葛根慢，Tmax較葛根快，Cmax較葛根高；③大豆苷元：AUC較葛根大，CL比葛根慢，t1/2較葛根快，Tmax和全方一致，Cmax較葛根高。 葛根及葛根芩連湯中沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照

9、的成分（物質(zhì)A），血中產(chǎn)生代謝產(chǎn)物（物質(zhì)B）；④物質(zhì)A：AUC比葛根大，CL比葛根快，t1/2較葛根快，Tmax較葛根快，Cmax較葛根高；⑤物質(zhì)B：AUC比葛根小，CL比葛根慢，t1/2較葛根快，Tmax較葛根快，Cmax較葛根高。 （2）葛根芩連湯與單味黃連中主要成分藥動(dòng)參數(shù)對(duì)比： ①鹽酸小檗堿：AUC比黃連小，CL比黃連高，t1/2較黃連慢，Tmax比黃連快，Cmax較黃連低；②巴馬?。篈UC比黃連小，CL比黃連高

10、，t1/2較黃連快，Tmax較黃連慢，Cmax較黃連低；③黃連堿：AUC較黃連小，CL比黃連高，t1/2較黃連慢，Tmax較黃連快，Cmax比黃連低。 結(jié)論: 1．黃連配伍葛根炙甘草、葛根、黃芩炙甘草、黃芩、炙甘草均能拮抗單味黃連對(duì)紅細(xì)胞滲透脆性的影響：葛根芩連湯、葛根黃連黃芩三藥配伍對(duì)G6PD-BD大鼠紅細(xì)胞滲透脆性無(wú)影響；說(shuō)明葛根芩連湯通過(guò)配伍能減低黃連對(duì)紅細(xì)胞滲透脆性的影響。糞便狀態(tài)的改變初步說(shuō)明葛根芩連湯、黃連葛

11、根甘草、黃連葛根配伍組的療效優(yōu)于單味黃連。 2．在機(jī)體正常狀態(tài)下給單味黃連和葛根芩連湯對(duì)腎臟和肝臟的毒性作用要大于在病理狀態(tài)下的，結(jié)果提示在治療疾病的情況下灌服單味黃連或葛根芩連湯全方對(duì)肝腎是安全的；在黃連同等劑量下單味黃連和葛根芩連湯對(duì)肝腎切片結(jié)果對(duì)比提示，單味黃連的毒性大于葛根芩連湯全方；中高劑量的單味黃連和葛根芩連湯能對(duì)肝臟產(chǎn)生一定的毒性，對(duì)腎臟的毒性小于肝臟。 3．葛根芩連湯及單味葛根中的葛根素、大豆苷、大豆苷元

12、和物質(zhì)A藥動(dòng)參數(shù)結(jié)果顯示：全方中各成分的AUC都比單味葛根大，Cmax都比單味葛根高，說(shuō)明葛根配伍黃芩、黃連和甘草能提高葛根主要成分的入血量和血清中濃度，突出了葛根在葛根芩連湯中君藥的地位。四種成分在葛根芩連湯和單味葛根的t1/2和Tmax有快有慢，也有一致的，CL值有高有低，說(shuō)明葛根中各成分體內(nèi)吸收代謝是多樣性的。 葛根芩連湯全方中的鹽酸小檗堿、巴馬汀和藥根堿AUC比單味黃連藥材小，說(shuō)明黃連配伍后可以降低這三種成分的入血量；C

13、L都比單味黃連高，說(shuō)明黃連在配伍后這三種成分代謝加快。黃連單煎液中的鹽酸小檗堿、巴馬汀和藥根堿的Cmax也較全方高，該結(jié)果提示全方配伍能抑制黃連各成分吸收入血，從而使其在腸道內(nèi)發(fā)揮作用。黃連中這三種主要成分的Tmax和t1/2在單味黃連和葛根芩連湯全方中各有不同，再一次提示了中藥成分體內(nèi)過(guò)程的復(fù)雜性和多樣性。 綜上所述，大鼠的隱血實(shí)驗(yàn)和病理切片結(jié)果顯示：黃連的部分毒性在通過(guò)配伍后能降低；通過(guò)比格犬中黃連主要成分藥動(dòng)學(xué)研究結(jié)果進(jìn)一