優(yōu)化rAAV載體以高效轉(zhuǎn)導(dǎo)HSCs并介導(dǎo)紅系特異性蛋白表達(dá).pdf

1、前言：β-地中海貧血、鐮刀細(xì)胞性貧血等血紅蛋白疾病是由β-珠蛋白基因單點(diǎn)突變所導(dǎo)致的、全世界發(fā)病率最高的遺傳病。目前唯一可以根治此類疾病的治療方法是異體骨髓移植，缺少與患者人類白細(xì)胞抗原(HLA)相匹配的骨髓供體極大程度上限制了異體骨髓移植的應(yīng)用，因此，尋找替代異體骨髓移植的治療方法極為重要。隨著人類對生命科學(xué)的深入了解，基因轉(zhuǎn)移技術(shù)的研究日益深入，基因治療成為各種遺傳性或獲得性疾病治療的新的希望。自上個世紀(jì)九十年代美國第一例基因治療臨

2、床試驗(yàn)開展以來，全世界已開展了超過1800個基因治療臨床試驗(yàn)項(xiàng)目[1]?；蛑委煂Ζ?地中海貧血與鐮刀細(xì)胞性貧血這類單基因突變引起的遺傳病的治療尤為理想。以病人自身的造血干細(xì)胞(HSCs)為靶細(xì)胞，通過病毒載體或非病毒載體導(dǎo)入正常的β-珠蛋白基因，再將基因修飾后的自體骨髓細(xì)胞回輸入病人體內(nèi)，這種結(jié)合了基因治療的自體骨髓移植成為替代異體骨髓移植最有前景的治療方法。2010年有報道表明，重組慢病毒載體攜帶正常β-珠蛋白基因在臨床試驗(yàn)中在一定

3、程度上糾正了患有重型β-地中海貧血病人的貧血癥狀，但受試病人在可減少輸血頻率的同時，也出現(xiàn)了癌前基因HMGA2的轉(zhuǎn)錄激活[2]，因此，慢病毒基因載體的安全性，仍是其在基因治療應(yīng)用中最大的隱患。在諸多的病毒載體中，腺相關(guān)病毒(AAV)是唯一被美國國立衛(wèi)生研究院(NIH)及美國食品和藥品管理局(FDA)劃分在安全級別一級(RG1)的病毒，即不導(dǎo)致任何疾病的病毒載體。其中，由于2型腺相關(guān)病毒載體(AAV2)的安全性及其對多種組織細(xì)胞的高轉(zhuǎn)導(dǎo)效

4、率，AAV2已被廣泛應(yīng)用于多種疾病基因治療Ⅰ-Ⅲ期的臨床試驗(yàn)，如肺囊性纖維化[3]、血友病B[4]、先天性黑蒙癥[5-7]等。2012年，歐洲藥品管理局(EMEA)批準(zhǔn)了由荷蘭uniQure公司研制與申報的基因藥物Glybera的正式上市[8，9]。該藥以AAV為載體，轉(zhuǎn)導(dǎo)脂蛋白脂酶基因以治療脂蛋白脂酶缺乏癥，是全球第一個上市的AAV基因藥物。Glybera獲準(zhǔn)上市，進(jìn)一步證明了AAV載體的安全性與有效性，AAV介導(dǎo)的基因治療研究成為目

5、前國際研究熱點(diǎn)。然而，AAV2對HSCs的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率不夠理想[10-17]，且其他新型AAV血清型如AAV1-AAV10對HSCs的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的研究，目前鮮有報道。在此類疾病基因治療的前期研究中，小鼠、猴是常用的動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，但AAV各種血清型對小鼠、猴及人HSCs的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率是否存在種屬差異性尚無任何報道。最近，本實(shí)驗(yàn)室對AAV2外殼蛋白進(jìn)行定點(diǎn)突變改造，可大幅度提高AAV2對肝臟等組織/細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率[18]。但定點(diǎn)突變外殼蛋白是否可以提

6、高AAV對HSCs的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，目前仍是一個空白區(qū)域。血紅蛋白疾病的基因治療，不僅僅需要載體對HSCs的高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，還需要載體介導(dǎo)靶基因在紅系高效且特異性表達(dá)目的蛋白，因此，優(yōu)化啟動子以提高其活性及紅系特異性極為關(guān)鍵。對以上問題的深入研究，將有望提高AAV對HSCs的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，并介導(dǎo)目的基因在紅系高效特異性表達(dá)，有望為此類血紅蛋白疾病的基因治療提供理想載體，為其臨床應(yīng)用提供依據(jù)。
　　目的：①分析AAV對來源于小鼠、猴與人HSCs轉(zhuǎn)

7、導(dǎo)效率的種屬差異性，在血清型AAV1-10中，篩選出對人HSCs轉(zhuǎn)導(dǎo)效率最高的AAV血清型，以在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中指導(dǎo)AAV血清型的選擇及最佳動物模型的選擇;②對轉(zhuǎn)導(dǎo)人HSCs的最佳血清型的受體/輔受體進(jìn)行系統(tǒng)篩選與分析，并研究該血清型的整合特性，以明確該最佳血清型對人HSCs高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的機(jī)制，并為將來的臨床試驗(yàn)提供篩選病人的指標(biāo);③對最佳AAV血清型的外殼蛋白進(jìn)行單點(diǎn)突變，在體外及體內(nèi)篩選最佳單點(diǎn)突變型載體，并聯(lián)合單點(diǎn)氨基酸突變構(gòu)建雙突變型載

8、體，以進(jìn)一步提高對人HSCs的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率;④優(yōu)化載體啟動子，構(gòu)建含紅系特異性啟動子B19p6的雙突變型載體以介導(dǎo)紅系特異性蛋白表達(dá)。
　　方法與結(jié)果：⑴系統(tǒng)包裝攜帶增強(qiáng)綠色熒光蛋白(EGFP)報告基因的AAV1-AAV10載體，體外比較其對來源于小鼠，猴及人的HSCs的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。結(jié)果表明:10個血清型中，AAV1對小鼠Sca-1+，c-kit+，lin-細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高于其它血清型，但對人CD34+細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)效率較低;AAV6對小鼠S

9、ca-1+，c-kit+，lin-細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率并不理想，但AAV6對人CD34+細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)效率顯著高于其他血清型;而AAV1-10對猴CD34+細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率都不理想。說明AAV對HSCs的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率存在顯著的物種差異性;⑵以人紅白血病細(xì)胞(K562)為細(xì)胞模型，通過血清抑制試驗(yàn)、紅細(xì)胞糖苷競爭實(shí)驗(yàn)、肝素競爭實(shí)驗(yàn)、成纖維生長因子(bFGF)競爭實(shí)驗(yàn)、胰島素樣生長因子1(IGF-1)競爭實(shí)驗(yàn)等競爭性抑制實(shí)驗(yàn)，與細(xì)胞糖基化抑制、磷脂酶A2、唾

10、液酸苷酶、蛋白酶K等細(xì)胞處理實(shí)驗(yàn)及載體示蹤記錄實(shí)驗(yàn)，對AAV6所介導(dǎo)的高效且長期的蛋白表達(dá)機(jī)制進(jìn)行研究。在示蹤實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)用Cy3標(biāo)記不同的AAV血清型的外殼蛋白，并應(yīng)用共聚焦顯微鏡檢查病毒進(jìn)入靶細(xì)胞的情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn):AAV6進(jìn)入靶細(xì)胞的幾率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他血清型，這可能是其高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的主要原因。除血清以外，紅細(xì)胞糖苷、肝素、bFGF與IGF-1對AAV6的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率無競爭性抑制作用。應(yīng)用唾液酸酶、磷脂酶A2等對細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理對轉(zhuǎn)導(dǎo)效率無顯著影

11、響，而用蛋白酶K預(yù)處理細(xì)胞可降低AAV6的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。⑶通過定點(diǎn)突變的方法，將對人CD34+細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)效率最高的AAV6外殼蛋白表面的Y252等六個酪氨酸殘基(Y)突變?yōu)楸奖被釟埢?F)，并分別包裝雙鏈AAV-EGFP載體或單鏈AAV-mCherry載體，在體外篩選單點(diǎn)突變載體對人CD34+細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Y705F等單點(diǎn)突變對人CD34+細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率顯著高于未突變及其它單點(diǎn)突變載體。本實(shí)驗(yàn)室進(jìn)一步應(yīng)用包含單點(diǎn)突變的病毒載體轉(zhuǎn)

12、導(dǎo)人CD34+細(xì)胞，進(jìn)行NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl(NOD/SCID)免疫缺陷小鼠異種移植實(shí)驗(yàn)，檢測這些單點(diǎn)突變載體在體內(nèi)介導(dǎo)基因的表達(dá)情況。結(jié)果進(jìn)一步證實(shí):所構(gòu)建的包含酪氨酸單點(diǎn)突變的AAV6載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率顯著高于未突變型載體，可介導(dǎo)目的基因長期高效表達(dá)。⑷結(jié)合兩個最佳單點(diǎn)突變，構(gòu)建雙突變載體，有望進(jìn)一步提高載體對人HSCs的高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。同時，構(gòu)建含非特異性啟動子CBAp，及紅系特異性啟動子B19p6或HS2-

13、βp驅(qū)動下的雙鏈AAV-EGFP以及雙鏈AAV-GLuc病毒載體，可對其在體內(nèi)、體外介導(dǎo)的基因表達(dá)情況進(jìn)行直觀的比較與分析。對HSCs在體外進(jìn)行紅系特異性誘導(dǎo)分化，可比較分化前后轉(zhuǎn)導(dǎo)基因在不同啟動子驅(qū)動下的表達(dá)水平以分析啟動子的紅系特異性。結(jié)果表明，與分化前相比，B19p6與HS2-βp啟動子驅(qū)動下，基因表達(dá)分別可以提高30倍與22倍，而CBAp啟動子驅(qū)動下的基因表達(dá)，在誘導(dǎo)前后無顯著性差異。⑸在NOD.Cg-Prkdcscid I12

14、rgtm1Wj1/SzJ(NSG)小鼠模型中平行比較三種啟動子驅(qū)動下的未突變型AAV6及雙突變型AAV6載體所介導(dǎo)的基因表達(dá)水平。該部分研究進(jìn)行了兩次移植實(shí)驗(yàn)，第一次將經(jīng)載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的人HSCs移植入NSG小鼠，移植后第3周開始直至第12周進(jìn)行基因表達(dá)水平監(jiān)控，并于移植后的第12周，處死受體鼠，分離其骨髓細(xì)胞及脾臟細(xì)胞，檢測人細(xì)胞的百分比，以確定異種移植是否成功，并進(jìn)一步檢測各種細(xì)胞的基因表達(dá)水平，以確定基因表達(dá)是否局限于紅系特異性。同時，

15、將首次移植成功的受體鼠的骨髓細(xì)胞再次移植入新的NOD/SCID鼠或NSG小鼠，重復(fù)以上檢測，繼續(xù)評估載體介導(dǎo)目的基因的長期表達(dá)情況。結(jié)果表明，B19p6啟動子驅(qū)動下的雙突變AAV6載體所介導(dǎo)的基因表達(dá)水平最高。
　　結(jié)論：本研究所構(gòu)建的B19p6啟動子驅(qū)動下的包含雙突變的AAV6載體為以HSCs為靶細(xì)胞的遺傳性疾病，尤其是β-地中海貧血或鐮刀細(xì)胞性貧血等血紅蛋白疾病的基因治療研究提供了安全有效的理想載體，對此類疾病的基因治療最終走