pcsk9基因功能獲得型和缺失型突變真核表達載體的構(gòu)建及初步鑒定.pdf

1、目的: 構(gòu)建pcsk9功能獲得型突變與功能缺失型突變基因真核表達載體，并完成初步鑒定，為明確pcsk9與內(nèi)皮細胞損傷和泡沫細胞形成的具體聯(lián)系提供研究手段，為研究As機制及防治提供新的思路。
　　方法: 1.培養(yǎng)人肝細胞株（BLE7402），收集細胞提取RNA，去除DNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈。以cDNA第1鏈為模板，擴增pcsk9基因編碼區(qū)全長，鑒定擴增產(chǎn)物。按照Target clone-plus試劑盒操作說明對pcsk9進行

2、加A反應，純化，將pcsk9 cDNA與pMD18-T載體連接。將pMD18-T-pcsk9載體轉(zhuǎn)化入DH-5α大腸桿菌感受態(tài)細胞，利用含AmpLB的固體平板倒置培養(yǎng)，挑取單克隆，搖菌，提取質(zhì)粒，Hind III和XbaI酶切，測序鑒定。提取pMD18-T- pcsk9，設計引物擴增，在其3’端添加Flag標簽，酶切，純化。同法將pcDNA4.0轉(zhuǎn)化擴增，提取質(zhì)粒，酶切純化后與pcsk9-Flag連接，構(gòu)建pcDNA4.0-pcsk9質(zhì)

3、粒，去除內(nèi)毒素。2.選擇pcsk9獲得型突變（S127R）與缺失型突變(L253F)，分別設計定點突變引物，以野生型pcsk9載體為模板定點誘變，構(gòu)建pcsk9兩種突變型真核表達載體。如上將突變型質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細菌XL10GOLD，提取質(zhì)粒，測序驗證并去除內(nèi)毒素。3.培養(yǎng)THP-1細胞至最佳狀態(tài)，細胞計數(shù)，分入24孔板。按照Lipofectamine?LTX轉(zhuǎn)染說明，分別pcsk9野生型質(zhì)粒、pcsk9- S127R質(zhì)粒、pcsk9-

4、L253F質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進入THP-1細胞，24小時后用佛波酯誘導，并在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染結(jié)果。4.利用RT-PCR、Western blot檢測轉(zhuǎn)染后THP-1細胞pcsk9 mRNA和蛋白、LDLR表達情況，進一步驗證轉(zhuǎn)染是否成功。
　　結(jié)果: 提取總RNA，取5ml稀釋100倍測OD值為1.9，電泳發(fā)現(xiàn)28S rRNA、18S rRNA條帶清晰，前者亮度約為后者1.5-2.0倍，5S rRNA條帶模糊。擴增pcsk9基因編碼區(qū)全

5、長，電泳圖上發(fā)現(xiàn)2.1kb左右的條帶，與pcsk9基因編碼區(qū)（2079bp）大小相符。 pMD18-T- pcsk9載體轉(zhuǎn)化16h，出現(xiàn)散在白色菌落?；驕y序發(fā)現(xiàn)所測基因與pcsk9同一性100％，堿基缺失率0%。
　　構(gòu)建pcsk9野生型真核表達載體，酶切電泳發(fā)現(xiàn)2.1 kb和5.1 kb處分別出現(xiàn)條帶，與pcsk9基因（2079bp）和pcDNA4.0（5078bp）載體大小相符。構(gòu)建功能獲得型突變pcDNA4.0-pcsk9

6、-S127R真核表達載體，測序發(fā)現(xiàn)pcsk9DNA第381位堿基由T變成A，構(gòu)建功能缺失型突變pcDNA4.0-pcsk9-L253F真核表達載體，測序發(fā)現(xiàn)pcsk9 DNA第757位堿基由C變成T。
　　將pcsk9野生型質(zhì)粒、pcsk9-S127R質(zhì)粒、pcsk9-L253F質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進入THP-1，熒光顯微鏡下發(fā)現(xiàn)正常對照組無發(fā)綠色熒光細胞，pcsk9野生型質(zhì)粒組、pcsk9-S127R質(zhì)粒組、pcsk9-L253F質(zhì)粒組有發(fā)

7、綠色熒光細胞。
　　檢測轉(zhuǎn)染后 THP-1 pcsk9mRNA表達情況，電泳發(fā)現(xiàn)正常對照組無條帶， pcsk9野生型質(zhì)粒組、pcsk9- S127R質(zhì)粒組、pcsk9- L253F質(zhì)粒組有大小相似條帶。
　　檢測轉(zhuǎn)染后THP-1 PCSK9蛋白表達情況，Western blot分析發(fā)現(xiàn)60KD處（PCSK9）正常對照組無條帶，pcsk9野生型質(zhì)粒組、pcsk9-S127R質(zhì)粒組、pcsk9-L253F質(zhì)粒組有大小相似條帶。<

8、br>　　檢測轉(zhuǎn)染后 THP-1 LDLR蛋白表達情況，Western blot分析發(fā)現(xiàn)93KD處（LDLR大?。┨巔csk9-L253F質(zhì)粒組條帶灰度值最大，正常對照組次之，pcsk9野生型質(zhì)粒組第三，pcsk9-S127R質(zhì)粒組最小，方差分析，發(fā)現(xiàn)組間差異有顯著性（p<0.05）。
　　結(jié)論: 構(gòu)建了pcsk9功能獲得型（S127R）和功能缺失型（L253F）突變真核表達載體，并驗證其構(gòu)建成功，為明確pcsk9與內(nèi)皮損傷和泡沫