人乳頭瘤病毒16E7型相關(guān)多肽IgY抗體的制備與活性研究.pdf

1、目的:本研究通過人工合成HPV16E7多肽,制備抗HPV16E7多肽卵黃抗體(IgY),并經(jīng)胃蛋白酶消化后獲得IgY-Fab’片段,進一步研究IgY-Fab’片段的生物活性和穩(wěn)定性。
　　研究方法與結(jié)果:根據(jù)前期所針對HPV16E7蛋白的MHC-Ι抗原結(jié)合表位,利用蛋白質(zhì)軟件分析方法,以前期篩選出的3段一致性較高及免疫原性較強的HPV16E7多肽序列做為研究對象,氨基酸序列分別為CCKCDSTLR、GIVCPICSQ、LLMGTL

2、GIV。采用固相合成多肽方法,在自動多肽合成儀上分別合成多肽,最后經(jīng)HPLC純化,多肽合成純度均>98％,分子質(zhì)量經(jīng)MS分析分別為1028.24、919.4、916.2。并與牛血清白蛋白(BSA)偶聯(lián)作為抗原免疫產(chǎn)蛋雞,制備抗多肽HPV16E7IgY多克隆抗體,采用聚乙二醇三步沉淀法,與卵黃液比例為1:6,pH值為7.2時所提取分離特異性抗體的純度比聚乙二醇二步沉淀法純度高,經(jīng)SDS-PAGE電泳分析結(jié)果,IgY重鏈分子量約為64KDa

3、的和輕鏈分子量約26KDa,Bandscan軟件分析純度達到85.4%,離子交換層析進一步純化抗體,純度大于91%。間接非競爭酶聯(lián)免疫吸附法檢測抗體效價,抗體效價分別為1:62500;1:312500;1:312500。
　　選取最高效價的抗HPV16E7b-IgY抗體進一步用胃蛋白酶消化IgY,在質(zhì)量比1:20消化時間為9h后,可獲得單一的IgY-Fab’片段,進一步純化IgY-Fab’片段,純化的Fab’片段蛋白濃度為0.76

4、2mg/mL,純度為92%,SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示Fab’的相對分子質(zhì)量為44KDa,效價達到1:32000,在相同的包被抗原濃度與抗體稀釋度的條件下,與HPV16E7IgY抗體相比,IgY-Fab’片段的活性仍能保持在65%以上;在耐酸、耐堿等穩(wěn)定性研究中,IgY-Fab’片段在65℃、pH>3、在堿性環(huán)境下活性仍能保持穩(wěn)定,無明顯變化。
　　結(jié)論:最終合成抗HPV16E7相關(guān)多肽,與BSA偶聯(lián)后作為免疫原,制備了高效價的