人乳頭瘤病毒16（HPV-16）E6-E7基因原核表達(dá)、不同啟動(dòng)子的載體構(gòu)建及其動(dòng)物模型的研究.pdf

1、人乳頭瘤病毒(humanpapillomavims，HPV)是一種無包膜的環(huán)狀閉合雙鏈DNA病毒，在鱗狀上皮細(xì)胞層進(jìn)行病毒復(fù)制。迄今，已發(fā)現(xiàn)l00多種HPV型，其中只有少數(shù)高危型的HPV易引起宮頸癌。高危型HPV(如HPV-16、18、31)與生殖道感染有關(guān)并且可以通過基因組整合入宿主細(xì)胞染色體中，引起細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，從而使生殖系統(tǒng)癌變。低危型HPV(如HPV6、11)主要引起尖銳濕疣等良性增生。 HPV基因組的早期區(qū)編碼干擾細(xì)胞

2、周期調(diào)控的E6／E7癌蛋白，高危型HPV的E6／E7癌蛋白能夠與宿主細(xì)胞靶向結(jié)合，并與轉(zhuǎn)錄活性有關(guān)，大多數(shù)研究者致力于研究HPV癌蛋白與靶細(xì)胞中蛋白質(zhì)的相互作用。E6蛋白通過泛素途徑降解p53,因此，在DNA受損傷時(shí)不能誘導(dǎo)細(xì)胞生長停滯或凋亡。E7結(jié)合pRB,p107,andp130,并使其降解，同時(shí)阻止Mi2組蛋白乙酰基轉(zhuǎn)移酶，誘導(dǎo)c-Myc,抑制TGFp信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。 HPV-16E6／E7的重要性已被人們所公認(rèn)。因此，為了

3、更多的了解HPV病毒感染、致癌機(jī)制、RNAi、臨床治療和疫苗的研制，我們需要從動(dòng)物組織、細(xì)胞、分子等不同水平研究HPV。 首先，用PCR方法從含有HPV-16全基因序列的質(zhì)粒上擴(kuò)增E6／E7基因，將E6／E7基因連接到pET-32a(+)質(zhì)粒上，經(jīng)酶切測序鑒定后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)細(xì)菌中?？剐陨L的克隆用異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)，溶解細(xì)胞，通過SDS-PAGE電泳檢測E6／E7蛋白的大小，同時(shí)用W

4、esternblot方法檢測E6蛋白。 其次，將質(zhì)粒pET-32a(+)-E6／E7擴(kuò)增、酶切獲得E6／E7片段插入腺病毒穿梭載體pAdTrack-CMV的巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子下游，構(gòu)建重組穿梭載體pAdTrack-CMV-E6／E7，將載體線性化后與骨架載體AdEasy．1在細(xì)菌BJ5183內(nèi)同源重組得到腺病毒質(zhì)粒pAd-CMV-E6／E7，PacI酶切、純化質(zhì)粒pAd-CMV-E6／E7后，用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染到人胚腎293細(xì)

5、胞中，3d后質(zhì)粒在細(xì)胞中包裝得到復(fù)制缺陷型重組腺病毒pAd-CMV-E6／E7，并在熒光顯微鏡下可觀察到綠色熒光蛋白(GFP)的表達(dá)，收獲病毒后氯化銫梯度離心純化病毒，將純化好的病毒再次感染293細(xì)胞，提取細(xì)胞中總RNA和總蛋白，RT-PCR和Westernblot檢測E6／E7的表達(dá)。 然后，用PCR方法從含有HPV-16全基因序列的質(zhì)粒上擴(kuò)增E6／E7基因，構(gòu)建pCDNA3．1(-)-K14-E6／E7-polA載體，擴(kuò)增、

6、酶切獲得K14-E6／E7-polA片段插入腺病毒穿梭載體質(zhì)粒pAdTrack上，構(gòu)建重組穿梭載體pAd-K14-E6／E7-polA，線性化后與骨架載體AdEasy．1在細(xì)菌BJ5183內(nèi)同源重組得到腺病毒質(zhì)粒pAd-K14-E6／E7-polA，經(jīng)人胚腎293細(xì)胞包裝后得到復(fù)制缺陷型重組腺病毒pAd-K14-E6／E7-polA；用包裝后的病毒上清再次感染293細(xì)胞，提取細(xì)胞中的總RNA，通過RT-PCR方法檢測E6／E7基因的表達(dá)

7、。 最后，將重組腺病毒pAd-CMV-E6／E7、pAd-K14-E6／E7病毒上清以及做為對(duì)照的重組腺病毒空載體pAd-CMV和pAdtrack的上清液，經(jīng)過純化后，通過裸鼠的尾緣靜脈注射到小鼠體內(nèi)，并每天注射0．05mg雌激素給注射病毒的小鼠，同時(shí)做陰性對(duì)照。7-8周后給小鼠注射2．5％的阿佛丁，將其耳部、眼部、頭頸部、口腔、結(jié)腸、直腸、子宮頸、卵巢及陰道部取出，浸泡在3.75％的多聚甲醛中4℃固定過夜，然后做石蠟包埋切片、