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文檔簡介
1、人乳頭瘤病毒(humanpapillomavims,HPV)是一種無包膜的環(huán)狀閉合雙鏈DNA病毒,在鱗狀上皮細胞層進行病毒復制。迄今,已發(fā)現(xiàn)l00多種HPV型,其中只有少數(shù)高危型的HPV易引起宮頸癌。高危型HPV(如HPV-16、18、31)與生殖道感染有關并且可以通過基因組整合入宿主細胞染色體中,引起細胞惡性轉化,從而使生殖系統(tǒng)癌變。低危型HPV(如HPV6、11)主要引起尖銳濕疣等良性增生。 HPV基因組的早期區(qū)編碼干擾細胞
2、周期調(diào)控的E6/E7癌蛋白,高危型HPV的E6/E7癌蛋白能夠與宿主細胞靶向結合,并與轉錄活性有關,大多數(shù)研究者致力于研究HPV癌蛋白與靶細胞中蛋白質(zhì)的相互作用。E6蛋白通過泛素途徑降解p53,因此,在DNA受損傷時不能誘導細胞生長停滯或凋亡。E7結合pRB,p107,andp130,并使其降解,同時阻止Mi2組蛋白乙?;D移酶,誘導c-Myc,抑制TGFp信號轉導通路。 HPV-16E6/E7的重要性已被人們所公認。因此,為了
3、更多的了解HPV病毒感染、致癌機制、RNAi、臨床治療和疫苗的研制,我們需要從動物組織、細胞、分子等不同水平研究HPV。 首先,用PCR方法從含有HPV-16全基因序列的質(zhì)粒上擴增E6/E7基因,將E6/E7基因連接到pET-32a(+)質(zhì)粒上,經(jīng)酶切測序鑒定后轉化到大腸桿菌BL21(DE3)細菌中??剐陨L的克隆用異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)誘導,溶解細胞,通過SDS-PAGE電泳檢測E6/E7蛋白的大小,同時用W
4、esternblot方法檢測E6蛋白。 其次,將質(zhì)粒pET-32a(+)-E6/E7擴增、酶切獲得E6/E7片段插入腺病毒穿梭載體pAdTrack-CMV的巨細胞病毒(CMV)啟動子下游,構建重組穿梭載體pAdTrack-CMV-E6/E7,將載體線性化后與骨架載體AdEasy.1在細菌BJ5183內(nèi)同源重組得到腺病毒質(zhì)粒pAd-CMV-E6/E7,PacI酶切、純化質(zhì)粒pAd-CMV-E6/E7后,用脂質(zhì)體轉染到人胚腎293細
5、胞中,3d后質(zhì)粒在細胞中包裝得到復制缺陷型重組腺病毒pAd-CMV-E6/E7,并在熒光顯微鏡下可觀察到綠色熒光蛋白(GFP)的表達,收獲病毒后氯化銫梯度離心純化病毒,將純化好的病毒再次感染293細胞,提取細胞中總RNA和總蛋白,RT-PCR和Westernblot檢測E6/E7的表達。 然后,用PCR方法從含有HPV-16全基因序列的質(zhì)粒上擴增E6/E7基因,構建pCDNA3.1(-)-K14-E6/E7-polA載體,擴增、
6、酶切獲得K14-E6/E7-polA片段插入腺病毒穿梭載體質(zhì)粒pAdTrack上,構建重組穿梭載體pAd-K14-E6/E7-polA,線性化后與骨架載體AdEasy.1在細菌BJ5183內(nèi)同源重組得到腺病毒質(zhì)粒pAd-K14-E6/E7-polA,經(jīng)人胚腎293細胞包裝后得到復制缺陷型重組腺病毒pAd-K14-E6/E7-polA;用包裝后的病毒上清再次感染293細胞,提取細胞中的總RNA,通過RT-PCR方法檢測E6/E7基因的表達
7、。 最后,將重組腺病毒pAd-CMV-E6/E7、pAd-K14-E6/E7病毒上清以及做為對照的重組腺病毒空載體pAd-CMV和pAdtrack的上清液,經(jīng)過純化后,通過裸鼠的尾緣靜脈注射到小鼠體內(nèi),并每天注射0.05mg雌激素給注射病毒的小鼠,同時做陰性對照。7-8周后給小鼠注射2.5%的阿佛丁,將其耳部、眼部、頭頸部、口腔、結腸、直腸、子宮頸、卵巢及陰道部取出,浸泡在3.75%的多聚甲醛中4℃固定過夜,然后做石蠟包埋切片、
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