氧化應激損傷在H1N1型流感病毒致宿主細胞凋亡中的研究.pdf

1、流行性感冒是嚴重影響人類健康的最常見的原因之一。進入21世紀以來，2006年的H5N1型禽流感、今年爆發(fā)流行的H1N1型流感，都給人類的工作和生活帶來嚴重影響。正因如此，流感病毒致病機理的研究一直都是醫(yī)學研究的熱點。目前，為廣大學者所接受的致病機理中，流感病毒誘導細胞凋亡和氧化應激損傷機制都是重要的學說，但關于兩種機制之間關系的研究國內(nèi)外未見報道。其它領域的研究證明，氧化應激可通過多條途徑導致細胞凋亡的發(fā)生。Xu JJ等人通過對培養(yǎng)的心

2、肌細胞研究，證明了氧化應激與凋亡之間的關系[1]；研究還發(fā)現(xiàn)在非肥胖糖尿病鼠胰島中存在過度氧化所致的凋亡現(xiàn)象[2]。在立足國內(nèi)外研究進展和流感病毒致病機制的基礎上，本研究將從新的視角探討流感病毒所致的細胞凋亡與氧化應激損傷之間的關系。
　　 目的：
　　 本課題旨在證明研究氧化應激損傷在流感病毒感染并最終致宿主細胞凋亡的過程中的存在；流感病毒感染宿主細胞可導致脂質(zhì)氧化損傷和DNA、RNA堿基氧化損傷。同時，通過對宿主細胞

3、氧化損傷程度與流感病毒致宿主細胞凋亡之間的關系研究，揭示流感病毒致宿主細胞的氧化損傷在宿主細胞凋亡中的作用。加強對流感病毒致宿主細胞氧化應激機制的認識，為該病毒致病機理研究提供了新的思路，為抗流感藥物的開發(fā)提供新的靶點，也為高致病性人禽流感的預防、防控提供了新的視角和依據(jù)。
　　 方法：
　　 第一部分：流感病毒實驗用毒劑量確定
　　 雞胚尿囊腔接種H1N1型流感病毒，經(jīng)病毒復制、擴增、收獲病毒，通過檢測MDCK

4、細胞的半數(shù)組織細胞感染劑量（TCID50），確定該毒株實驗用毒劑量，并經(jīng)預試驗給予驗證。
　　 第二部分：流感病毒感染MDCK細胞后的凋亡率檢測
　　 利用Annexin V-FITC/PI試劑盒檢測病毒感染MDCK細胞1h后繼續(xù)培養(yǎng)0h、1h、3h、6h、12h、24h、48h各時間點的凋亡率。
　　 第三部分：流感病毒感染MDCK細胞后MDA的含量檢測
　　 利用MDA檢測試劑盒檢測病毒感染MDCK細

5、胞1h后繼續(xù)培養(yǎng)0h、1h、3h、6h、12h、24h、48h各時間點的MDA含量。
　　 第四部分：流感病毒感染MDCK細胞后8-oxo-G表達情況檢測
　　 細胞爬片經(jīng)過不同的預處理，利用免疫組織化學染色SP法檢測病毒感染MDCK細胞1h后繼續(xù)培養(yǎng)0h、1h、3h、6h、12h、24h、48h各時間點的DNA中的8-oxo-G和RNA中8-oxo-G表達情況。
　　 結果：
　　 1.該毒株感染MDC

6、K細胞的TCID50為10-4.5/0.1ml，經(jīng)預實驗驗證確定毒株的實驗用毒劑量為100 TCID50。
　　 2.該毒株的實驗用毒劑量能感染并誘導MDCK細胞的凋亡，且凋亡率隨著檢測時間延長呈上升趨勢，前6h凋亡率與對照組無明顯差異（P>0.05），12h凋亡率開始上升達6.422％±0.326（P＜0.01），24h、48h分別為9.570％±0.229、9.178％±0.286，與對照組有明顯差異（P＜0.01）。

7、>　　 3.病毒感染細胞后，MDA含量隨著檢測時間的延長而下降，0h MDA水平達高峰1.490±0.053nmol/mgprot（P＜0.01），1-6h維持在較高水平，依次為1.221±0.036 nmol/mgprot，1.157±0.061 nmol/mgprot，1.089±0.038 nmol/mgprot（P＜0.01），12h后MDA水平明顯下降至0.636±0.033 nmol/mgprot （P＜0.01），24h

8、、48h MDA水平與對照組比較無顯著性差別（P>0.05）。
　　 4.該毒株感染MDCK細胞后，能誘導宿主細胞DNA和RNA中8-oxo-G的表達。DNA中8-oxo-G表達情況如下：含8-oxo-G的陽性細胞百分比隨著時間呈明顯上升趨勢（P＜0.05）。0h陽性細胞百分比已達12.20±3.16（P＜0.05），之后的1h、3h、6h、12h、24h陽性細胞百分比逐漸上升,各時間點陽性細胞百分比與對照組差異明顯（P＜0.0

9、1），48h陽性細胞百分比達到最高87.45±3.98（P＜0.01）。RNA中8-oxo-G表達情況如下：該毒株感染細胞之后，RNA中8-oxo-G表達情況隨時間呈明顯上升趨勢（P＜0.05），各時間點實驗組8-oxo-G陽性細胞表達情況依次為9.93±1.45；12.38±1.92；26.70±0.86；46.55±2.92；58.89±2.02；72.72±2.13；80.63±0.97（P＜0.01）。同時，細胞DNA中8-ox

10、o-G陽性百分比在1h、3h、6h、12h明顯高于同時間點細胞RNA中。
　　 結論：
　　 經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)：H1N1型流感病毒能明顯誘導宿主MDCK細胞凋亡，凋亡率隨著檢測時間延長升高；H1N1型流感病毒感染宿主MDCK細胞過程中存在脂質(zhì)氧化損傷，丙二醛濃度隨檢測時間推移呈下降趨勢，且凋亡率和MDA含量有高度三次方線性關系，關系方程為Y=23.09－42.17X+29.82X2－7.16X3，曲線的決定系數(shù)R2為0.998