FoxM1剪接異構(gòu)體FoxM1b參與乳腺癌細(xì)胞多西紫杉醇耐藥的機(jī)制研究.pdf

1、乳腺癌是當(dāng)今女性最常見的惡性腫瘤,其發(fā)病率居女性惡性腫瘤的首位,死亡率也逐年躍居前列,乳腺癌嚴(yán)重威脅著全球女性的身體健康和生活質(zhì)量。過去數(shù)十年時(shí)間里,我國(guó)乳腺癌的發(fā)病率和死亡率較低,但近10年來上升幅度尤其顯著?；熓侨橄侔┲委煹闹匾侄沃?合理的化療能明顯提高乳腺癌治療的有效性。臨床應(yīng)用于乳腺癌的化療藥物眾多,其中多西紫杉醇應(yīng)用更為廣泛,為治療轉(zhuǎn)移性乳腺癌的一線用藥?；熕幬锏哪退巻栴},在乳腺癌也是如此,對(duì)多西紫杉醇的耐藥也嚴(yán)重影響

2、乳腺癌治療的臨床療效和患者預(yù)后,故發(fā)現(xiàn)介導(dǎo)耐藥新靶點(diǎn)對(duì)于多西紫杉醇療效的預(yù)測(cè)和其個(gè)體化臨床應(yīng)用將有重要的意義。
　　選擇性剪接是指將同一種的前體mRNA剪接組成多種不同成熟mRNA剪接異構(gòu)體,最終產(chǎn)生結(jié)構(gòu)和功能各異的蛋白質(zhì)的一系列過程,又稱為可變剪接。蛋白終產(chǎn)物表型變化引起相互拮抗的功能和結(jié)構(gòu)特性。選擇性剪接普遍存在于真核細(xì)胞生物中,是基因表達(dá)復(fù)雜性和蛋白質(zhì)多樣性的主要原因。約75％的選擇性剪接發(fā)生在翻譯區(qū),使蛋白有了多樣性的變化

3、。選擇性剪接影響細(xì)胞生理、發(fā)育以及疾病等多個(gè)環(huán)節(jié)。研究選擇性剪接各項(xiàng)功能與機(jī)制及其產(chǎn)生的蛋白異構(gòu)體的功能,不僅對(duì)于各種常見腫瘤的診斷治療具有重要意義,而且影響深遠(yuǎn)。
　　轉(zhuǎn)錄因子FoxM1廣泛存在于各種真核生物的細(xì)胞中,是Forkhead轉(zhuǎn)錄因子家族中的重要一員。該家族的共同特征是具有進(jìn)化保守的DNA結(jié)合區(qū),即為“翼狀螺旋結(jié)構(gòu)”或稱“叉頭框”。FoxM1在細(xì)胞增殖、分化,細(xì)胞的衰老、凋亡等過程中起重要作用,其表達(dá)與調(diào)節(jié)細(xì)胞有絲分裂

4、、細(xì)胞周期密切相關(guān)。在FoxM1的三種剪接異構(gòu)體中,FoxM1b和FoxM1c具有轉(zhuǎn)錄活性,但FoxM1a的C端因含有外顯子A2而失去轉(zhuǎn)錄活性。因此,研究FoxM1尤其是FoxM1b剪接異構(gòu)體的表達(dá)、功能與調(diào)控機(jī)制等對(duì)腫瘤方面具有重要的意義。
　　本課題旨在研究FoxM1b剪接異構(gòu)體在乳腺癌中的表達(dá),探討FoxM1b與乳腺癌多西紫杉醇耐藥的關(guān)系及其調(diào)控機(jī)制。主要分為三個(gè)部分:
　　第一部分:FoxM1及FoxM1b剪接異構(gòu)體

5、在乳腺癌的表達(dá)方面的研究。首先利用一定濃度的多西紫杉醇長(zhǎng)期間斷刺激人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞,并篩選出耐藥細(xì)胞系MDA-MB-231/Doc,并進(jìn)行鑒定,發(fā)現(xiàn)耐藥細(xì)胞在加有各種濃度多西紫杉醇的培養(yǎng)基中,細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)狀態(tài)均明顯強(qiáng)于普通的MDA-MB-231細(xì)胞。MTT實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證兩種細(xì)胞的耐藥性,同樣得出MDA-MB-231/Doc對(duì)多西紫杉醇的耐藥性明顯強(qiáng)于MDA-MB-231細(xì)胞。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示,FoxM1在絕大多數(shù)人乳

6、腺癌組織中普遍高表達(dá)量,主要存在于胞漿和核內(nèi)。通過RT-PCR實(shí)驗(yàn)、Real-time PCR實(shí)驗(yàn)及蛋白印記檢測(cè)多種人乳腺癌細(xì)胞中FoxM1蛋白質(zhì)的表達(dá),包括6株細(xì)胞MDA-MB-468,MDA-MB-453,BT-549,MCF-7,MDA-MB-231,MDA-MB-231/Doc。同時(shí)對(duì)人乳腺癌組織進(jìn)行Real-time PCR檢測(cè)其表達(dá)。結(jié)果顯示,FoxM1a,FoxM1b,FoxM1c在6株人乳腺癌細(xì)胞中均有一定程度的表達(dá)。而

7、FoxM1b剪接異構(gòu)體的表達(dá)要高于FoxM1a及FoxM1c。同時(shí)我們還觀察到FoxM1b在MDA-MB-231/Doc的表達(dá)要明顯高于其親本細(xì)胞系MDA-MB-231。
　　第二部分:FoxM1b剪接異構(gòu)體對(duì)乳腺癌細(xì)胞中的影響。首先通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)分別用pcDNA3.1-FoxM1b和FoxM1 shRNA兩種質(zhì)粒建立過表達(dá)FoxM1b的MDA-MB-231細(xì)胞,建立干涉FoxM1的MDA-MB-231/Doc細(xì)胞,然后用G41

8、8篩選出穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。通過Real-time PCR與蛋白印跡實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)其在穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系中的FoxM1在mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)。進(jìn)一步通過MTT和平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)所建立的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的增殖及耐藥情況。通過對(duì)細(xì)胞系進(jìn)行細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡變化。結(jié)果顯示,在FoxM1b表達(dá)量高的細(xì)胞MDA-MB-231(FoxM1b)中,細(xì)胞增殖能力和耐藥性要明顯強(qiáng)于原細(xì)胞MDA-MB-231(Mock),而在干涉FoxM

9、1的細(xì)胞系MDA-MB-231/Doc(shRNA),細(xì)胞增殖能力和耐藥性比原細(xì)胞MDA-MB-231/Doc(Mock)出現(xiàn)明顯下降。同時(shí)發(fā)現(xiàn)在使FoxM1b表達(dá)量升高后,有細(xì)胞分裂增殖過程G2期比率下降和細(xì)胞凋亡比率下降。
　　第三部分:FoxM1b參與乳腺癌細(xì)胞多西紫杉醇耐藥的機(jī)制研究。為明確FoxM1b在乳腺癌多西紫杉醇耐藥過程中的調(diào)控機(jī)制,我們對(duì)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系進(jìn)行Real-time PCR和蛋白印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)FoxM1b下游可

10、能的效應(yīng)分子的表達(dá)水平。與多西紫杉醇耐藥相關(guān)的候選分子有MDR1、XRCC1、ERCC1、BRCA1和BRCA2等。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,FoxM1b的表達(dá)水平與BRCA1及Bcl-2兩種分子存在正相關(guān)。免疫組化結(jié)果顯示,在同一人乳腺癌組織中,FoxM1與BRCA1及Bcl-2均在胞漿與胞核內(nèi)有較高的表達(dá)。利用穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系進(jìn)行mRNA水平和蛋白水平的檢測(cè),我們發(fā)現(xiàn),在升高FoxM1b表達(dá)量后,BRCA1及Bcl-2的表達(dá)同步出現(xiàn)增加,反之亦然。從

11、而證明FoxM1b極有可能作為BRCA1和Bcl-2的上游分子,從而對(duì)兩者發(fā)揮調(diào)控作用。
　　綜上所述,FoxM1蛋白質(zhì)在大多數(shù)人正常組織中幾乎不表達(dá),而在乳腺癌組織中大都高表達(dá)。FoxM1三種剪接異構(gòu)體在乳腺癌組織和細(xì)胞中均有一定程度的表達(dá),以FoxM1b最為突出。FoxM1b的高表達(dá)與乳腺癌細(xì)胞多西紫杉醇耐藥密切相關(guān),且能調(diào)控BRCA1及Bcl-2的表達(dá)。因此FoxM1b mRNA水平表達(dá)可能是乳腺癌患者多西紫杉醇耐的一項(xiàng)重要