微小RNA-34a在乳腺癌細(xì)胞紫杉醇化療耐藥中的作用.pdf

1、研究背景：
　　 乳腺癌作為女性中發(fā)病排名第一的惡性腫瘤已經(jīng)嚴(yán)重影響到婦女的健康。雖然中國乳腺癌發(fā)病率低于歐美國家，但是隨著近年國內(nèi)經(jīng)濟(jì)發(fā)展加速，生活水平提高，飲食結(jié)構(gòu)及生活方式的改變，其發(fā)病率逐年遞增，特別是國內(nèi)經(jīng)濟(jì)較發(fā)達(dá)的地區(qū)，乳腺癌發(fā)病率的上升速度驚人。近年來，隨著疾病診療技術(shù)的提升，公眾對(duì)健康的愈發(fā)重視，乳腺癌死亡率較前有所下降，但是，由于目前對(duì)乳腺癌發(fā)病機(jī)制仍然未知，選擇何種治療手段及如何具體操作等問題仍然存在困惑。手

2、術(shù)一直以來都是乳腺癌的主要治療方案，但是作為一種全身性疾病，其綜合治療顯得更為關(guān)鍵。而其中化學(xué)治療有著特別重要的地位，不僅可以為早期乳腺癌患者在術(shù)后行輔助治療，進(jìn)一步防止腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，還可以為失去手術(shù)機(jī)會(huì)的晚期患者降低腫瘤分期，從而重新獲得手術(shù)機(jī)會(huì)，延長生存期。而紫杉醇作為治療乳腺癌的化療一線藥物，在治療中已取得了比較理想的效果，被廣泛運(yùn)用于臨床，許多患者也因此受益。然而，腫瘤細(xì)胞對(duì)該藥產(chǎn)生耐藥性是乳腺癌化療失敗的主要原因之一。故探

3、討乳腺癌化療耐藥的發(fā)生機(jī)制對(duì)臨床指導(dǎo)乳腺癌治療方案具有重要的價(jià)值。microRNAs(miRNAs)是近年發(fā)現(xiàn)的廣泛存在于真核生物中，一類長度約21-23個(gè)核苷酸不等的不參與編碼的短鏈小分子RNA。它可以通過與下游靶基因的編碼區(qū)或者非編碼區(qū)結(jié)合，改變其表達(dá)量，從而內(nèi)源性調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化、增殖、凋亡過程。而新近各項(xiàng)研究結(jié)果表明miRNAs的表達(dá)改變與多種腫瘤及多種化療藥物敏感性有著緊密關(guān)系。本研究通過采用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)改變miR34a在乳腺癌

4、細(xì)胞株中的表達(dá)水平，從而檢測(cè)其表達(dá)量的改變對(duì)乳腺癌紫杉醇化療耐藥的影響及其可能作用機(jī)制。
　　 目的：
　　 探討微小RNA-34a(microRNA-34a，miR-34a)表達(dá)水平改變對(duì)乳腺癌細(xì)胞紫杉醇化療耐藥的影響及作用機(jī)制。
　　 方法：
　　 設(shè)計(jì)人工合成的miR-34a模擬序列及干擾序列(miR-34a mimics，miR-34ainhibitor)，通過LipofectamineTM200

5、0轉(zhuǎn)染MCF-7及MCF-7/紫杉醇耐藥細(xì)胞株(MCF-7/TAXOL)，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(Real-time PCR)檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞中miR-34a表達(dá)水平，CCK8檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后腫瘤細(xì)胞經(jīng)紫杉醇干預(yù)后的細(xì)胞存活情況并檢測(cè)各自半數(shù)抑制濃度(IC50)，Western blot法檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染前后Bcl-2蛋白表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：
　　 1、應(yīng)用Real-time PCR法檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞株MCF-7、MCF-

6、7/TAXOL中miR-34a的表達(dá)，結(jié)果顯示，常規(guī)培養(yǎng)的MCF-7/TAXOL細(xì)胞株中miR-34a的表達(dá)量相對(duì)MCF-7明顯增高（6.91±2.04，P＜0.05）。
　　 2、經(jīng)miR-34a mimics轉(zhuǎn)染后的MCF-7中miR-34a表達(dá)較轉(zhuǎn)染相應(yīng)陰性序列的對(duì)照組表達(dá)明顯增高:(168.98±18.943) vs(0.99±0.12)，P＜0.001;相反，經(jīng)miR-34a inhibitor轉(zhuǎn)染后的MCF-7/TA

7、XOL中miR-34a表達(dá)較轉(zhuǎn)染相應(yīng)陰性序列的對(duì)照組明顯減少:(0.007±0.001) vs(0.97±0.02)，P＜0.001。
　　 3、將轉(zhuǎn)染miR-34a mimics和inhibitor及轉(zhuǎn)染相應(yīng)陰性對(duì)照序列(negativecontrol，NC)的兩株細(xì)胞分成兩組:經(jīng)miR-34a mimics轉(zhuǎn)染的MCF-7和轉(zhuǎn)染相應(yīng)NC的對(duì)照組MCF-7、經(jīng)miR-34a inhibitor轉(zhuǎn)染的MCF-7/TAXOL和轉(zhuǎn)染

8、相應(yīng)NC的對(duì)照組MCF-7/TAXOL。應(yīng)用CCK-8法檢分組測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞在紫杉醇不同濃度下的存活情況，當(dāng)MCF-7細(xì)胞中miR-34a表達(dá)上調(diào)時(shí)，MCF-7對(duì)紫杉醇的敏感性明顯降低，轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組的IC50分別為(9.91±0.58) vs(2.81±0.41)mg/L，P＜0.05;當(dāng)miR-34a表達(dá)下調(diào)時(shí)，MCF-7/TAXOL對(duì)紫杉醇的敏感性明顯增高，轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組的IC50分別為(2.67±0.48) vs(7.36±0.6

9、0) mg/L，P＜0.05。
　　 4、應(yīng)用Western blot方法分析miR-34a表達(dá)改變后，MCF-7和MCF-7/TAXOL中Bcl-2的表達(dá)情況，當(dāng)miR-34a表達(dá)上調(diào)時(shí)，MCF-7細(xì)胞中Bcl-2表達(dá)量明顯降低，轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組蛋白表達(dá)量分別為(0.11±0.01) vs(0.91±0.03)，P＜0.05;當(dāng)miR-34a表達(dá)下調(diào)時(shí)，MCF-7/TAXOL細(xì)胞中Bcl-2表達(dá)量明顯增加，轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組蛋白表達(dá)