鹽酸椒苯酮胺抗豚鼠耳蝸缺血-再灌注損傷作用及其機(jī)制.pdf

1、聽力障礙是影響公眾身體健康和生活質(zhì)量的重要因素，數(shù)以億計(jì)的人受到威脅。世界衛(wèi)生組織2013年2月27日在日內(nèi)瓦表示，全世界有3.6億人患有耳聾或聽力障礙，占全球人口的5％，其中三分之二在發(fā)展中國家。中國是世界上最大的發(fā)展中國家，有13億人口，聽力障礙殘疾人有2057萬，占全國人口的16.79％，絕大部分為感音神經(jīng)性聾。感音神經(jīng)性聾的病理改變主要是毛細(xì)胞損傷、螺旋神經(jīng)節(jié)、支持細(xì)胞及神經(jīng)末梢的器質(zhì)性改變，發(fā)病原因公認(rèn)有缺血、病毒感染、耳毒性

2、藥物中毒及老年性退行性變等，尤其缺血因素最為常見。而血流障礙中只有少數(shù)為單純的缺血損傷，大部分是缺血后的再灌注損傷。例如突發(fā)性耳聾，目前多認(rèn)為是內(nèi)耳微循環(huán)障礙所致的感音神經(jīng)性聾。有研究指出缺血后再灌注造成的損傷大于單純?nèi)毖斐傻膿p傷。所以探討內(nèi)耳缺血/再灌注損傷(I/RI)的機(jī)制將非常有利于內(nèi)耳疾病的研究。鹽酸椒苯酮胺(piperphentonamine hydrochloride，簡(jiǎn)稱椒苯酮胺，PPTA)是由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所合

3、成篩選出的化學(xué)創(chuàng)新藥。相關(guān)研究表明椒苯酮胺對(duì)缺血再灌注損傷的心肌具有保護(hù)作用，是鈣增敏劑類強(qiáng)心藥及心肌保護(hù)劑。另外有研究表明其對(duì)缺血再灌注損傷腦組織也有保護(hù)作用，但國內(nèi)外尚無椒苯酮胺抗內(nèi)耳缺血再灌注損傷作用的研究。本實(shí)驗(yàn)從聽覺功能、細(xì)胞形態(tài)、炎性因子及細(xì)胞凋亡四個(gè)方面對(duì)豚鼠耳蝸的(I/RI)進(jìn)行研究，旨在探討椒苯酮胺對(duì)內(nèi)耳（I/RI）的保護(hù)作用及可能機(jī)制，為椒苯酮胺用于缺血性內(nèi)耳疾病的治療提供藥理學(xué)依據(jù)。本研究分為四個(gè)部分：
　　

4、 第一部分：耳蝸缺血/再灌注(I/R)豚鼠模型的建立。
　　 目的：建立豚鼠耳蝸缺血/再灌注損傷模型，探討豚鼠耳蝸缺血/再灌注損傷后聽功能改變。
　　 方法：將24只健康、耳廓反射靈敏，體重200-250g豚鼠隨機(jī)分成3組，分別為正常組、空白對(duì)照組、缺血再灌注組。缺血再灌注模型通過暫時(shí)性微動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)椎動(dòng)脈、結(jié)扎線活結(jié)結(jié)扎右側(cè)頸總動(dòng)脈，實(shí)驗(yàn)中激光多普勒檢測(cè)耳蝸血流(CoBF)。各組動(dòng)物分別于手術(shù)前、缺血再灌注6h、2

5、4h、48h行聽性腦干反應(yīng)(auditory brainstem response，ABR)測(cè)定，觀察ABR各波潛伏期、Ⅰ-Ⅲ波間期和Ⅲ波閾值。
　　 結(jié)果：正常組、假手術(shù)組術(shù)前、術(shù)后ABR閾值無顯著變化;缺血再灌注組再灌注6小時(shí)、24小時(shí)后ABR閾值顯著升高(P＜0.05)，24小時(shí)達(dá)到高峰，48小時(shí)ABR閾值有所恢復(fù)，但未恢復(fù)正常。
　　 結(jié)論：通過暫時(shí)性微動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)椎動(dòng)脈及右側(cè)頸總動(dòng)脈，夾閉1小時(shí)制造缺血模型，

6、松開三條動(dòng)脈制造再灌注模型。可致耳蝸損傷，表現(xiàn)為聽功能下降，在再灌注后6h、24h、48h，以24h聽閾最高，即耳蝸損傷最為嚴(yán)重。
　　 第二部分：PPTA時(shí)耳蝸缺血再灌注損傷的聽力保護(hù)作用及耳蝸組織掃描電鏡和透射電鏡觀察。
　　 目的：探討鹽酸椒苯酮胺(PPTA)對(duì)豚鼠耳蝸缺血再灌注損傷后聽功能及耳蝸形態(tài)的影響。
　　 方法：采用前述的缺血再灌注模型，將32只豚鼠隨機(jī)分為4組，每組8只，每組4只用于掃描電鏡觀察

7、，剩余4只用于透射電鏡觀察。分為正常組，假手術(shù)組，缺血再灌注對(duì)照組，缺血再灌注+鹽酸椒苯酮胺組。缺血再灌注+鹽酸椒苯酮胺組再灌注后立即經(jīng)股靜脈注射鹽酸椒苯酮胺，缺血再灌注對(duì)照組以等量生理鹽水代替椒苯酮胺注射。測(cè)量實(shí)驗(yàn)前后各組的聽性腦干反應(yīng)(ABR)波Ⅲ反應(yīng)閾的變化。24小時(shí)迅速斷頭取聽泡，在掃描電鏡、透射電鏡下觀察耳蝸結(jié)構(gòu)。
　　 結(jié)果：⑴正常組、假手術(shù)組實(shí)驗(yàn)前后ABR波Ⅲ反應(yīng)閾值無顯著變化(P＞0.05)，缺血再灌注對(duì)照組，造

8、模成功后ABR波Ⅲ顯著升高(P＜0.05)，缺血再灌注+鹽酸椒苯酮胺組，造模成功后ABR波Ⅲ升高，但低于缺血再灌注對(duì)照組(P＜0.05)。⑵掃描電鏡下觀察耳蝸組織的形態(tài)學(xué)變化:正常組及空白對(duì)照組豚鼠耳蝸基底膜居外側(cè)3排外毛細(xì)胞，1排內(nèi)毛細(xì)胞呈刷狀，排列整齊，內(nèi)、外毛細(xì)胞纖毛排列整齊，無缺失、倒伏。缺血再灌注對(duì)照組外毛細(xì)胞腫脹、缺失，纖毛排列紊亂、倒伏，部分缺失。缺血再灌注+鹽酸椒苯酮胺組少量外毛細(xì)胞有纖毛倒伏。⑶透射電鏡下觀察:正常組及

9、空白對(duì)照組耳蝸毛細(xì)胞細(xì)胞核圓、核染色質(zhì)分布均勻，線粒體形態(tài)正常，分布均勻，毛細(xì)胞突觸結(jié)構(gòu)清晰。螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元未見明顯脫髓鞘改變，血管紋內(nèi)皮細(xì)胞核呈梭形;IR組耳蝸毛細(xì)胞核邊界不清，可見固縮、邊集現(xiàn)象，突觸結(jié)構(gòu)消失。螺旋神經(jīng)節(jié)可見大量脫髓鞘改變。血管紋內(nèi)皮細(xì)胞核可見固縮、邊集現(xiàn)象，呈現(xiàn)充血改變;缺血再灌注+鹽酸椒苯酮胺組毛細(xì)胞核邊界清楚，核染色質(zhì)分布均勻，線粒體形態(tài)分布均勻，無明顯腫脹，突觸結(jié)構(gòu)尚清晰。螺旋神經(jīng)節(jié)可見少量脫髓鞘變。血管紋

10、內(nèi)皮細(xì)胞核膜完整，無固縮、邊集現(xiàn)象。
　　 結(jié)論：PPTA對(duì)豚鼠耳蝸的缺血再灌注聽力損傷有保護(hù)作用，并且可以防止耳蝸缺血再灌注損傷后毛細(xì)胞的損傷缺失。
　　 第三部分：鹽酸椒苯酮胺對(duì)缺血再灌注后IL-1β和TNF-α的mRNA表達(dá)的影響。
　　 目的：①探討耳蝸炎性反應(yīng)與缺血再灌注損傷的關(guān)系。②探討缺血再灌注后豚鼠耳蝸IL-1β和TNF-α的mRNA的表達(dá)與炎性反應(yīng)的關(guān)系。③探討PPTA對(duì)豚鼠耳蝸缺血再灌注損傷的

11、保護(hù)作用機(jī)制。
　　 方法：采用前述的缺血再灌注模型，將24只豚鼠隨機(jī)分為4組，每組6只，分別為正常組、假手術(shù)組、缺血再灌注對(duì)照組和缺血再灌注PPTA組。缺血再灌注PPTA組于缺血1小時(shí)再灌注后立即經(jīng)股靜脈注射鹽酸椒苯酮胺(10mg/kg)，缺血再灌注對(duì)照組以等量生理鹽水代替椒苯酮胺注射，24小時(shí)后取標(biāo)本。用RT-PCR法檢測(cè)IL-1β和TNF-α的mRNA的表達(dá)。用SPSS13.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，若滿足方差齊性，用

12、LSD檢驗(yàn)比較組間差異，若不滿足方差齊性，用Dunnett'sT3比較組間差異，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：缺血再灌注對(duì)照組耳蝸組織IL-1βmRNA表達(dá)量顯著高于正常組和假手術(shù)組(P＜0.001);缺血再灌注PPTA保護(hù)組耳蝸組織IL-1βmRNA表達(dá)量顯著低于缺血再灌注對(duì)照組(P＜0.001);缺血再灌注PPTA保護(hù)組耳蝸組織IL-1βmRNA表達(dá)量與正常組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.056＞0.05)。缺血再灌

13、注對(duì)照組耳蝸組織TNF-α mRNA表達(dá)量顯著高于正常組和假手術(shù)組(P＜0.001);缺血再灌注PPTA保護(hù)組耳蝸組織TNF-αmRNA表達(dá)量顯著低于缺血再灌注對(duì)照組(P＜0.001);缺血再灌注PPTA保護(hù)組耳蝸組織TNF-αmRNA表達(dá)量高于正常組(P=0.009＜0.05)。
　　 結(jié)論：⑴PPTA具有拮抗耳蝸組織缺血再灌注損傷作用；⑵PPTA可能通過抑制炎性反應(yīng)實(shí)現(xiàn)對(duì)耳蝸缺血再灌注損傷的拮抗作用。
　　 第四部分

14、 PPTA時(shí)豚鼠耳蝸缺血再灌注損傷后細(xì)胞凋亡和Fas蛋白、caspase-1的mRNA表達(dá)的影響
　　 目的：①觀察缺血再灌注損傷后豚鼠耳蝸細(xì)胞凋亡的情況。②對(duì)缺血再灌注損傷后豚鼠耳蝸Fas蛋白、caspase-1的mRNA的表達(dá)與細(xì)胞凋亡間的關(guān)系進(jìn)行分析。③探討PPTA對(duì)豚鼠缺血再灌注損傷后凋亡細(xì)胞的保護(hù)作用。
　　 方法：采用前述的缺血再灌注模型，將48只豚鼠隨機(jī)分為4組，每組12只，分別為正常組、假手術(shù)組、缺血再灌

15、注組對(duì)照組、缺血再灌注PPTA組（缺血60min行再灌注后立即經(jīng)股靜脈注射10mg/kg鹽酸椒苯酮胺），缺血再灌注對(duì)照組以等量生理鹽水代替椒苯酮胺注射，24小時(shí)后取標(biāo)本。用免疫組織化學(xué)法(SP)觀察Fas蛋白的表達(dá)和分布，并用Motic圖象分析系統(tǒng)分析單位面積下陽性細(xì)胞的積分光密度(IOD);用TUNEL法觀察細(xì)胞凋亡的情況;用RT-PCR法檢測(cè)caspase-1的mRNA的表達(dá)，并比較PPTA干預(yù)前后的變化。運(yùn)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟

16、件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，用LSD檢驗(yàn)比較組間差異，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：免疫組織化學(xué)染色見正常組、假手術(shù)組和缺血再灌注PPTA組耳蝸血管紋、螺旋神經(jīng)節(jié)、Corti器Fas表達(dá)為弱陽性，缺血再灌注組表達(dá)顯著增強(qiáng)。IOD值顯示正常組、假手術(shù)組、缺血再灌注PPTA組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，缺血再灌注組較其他三組顯著增強(qiáng)(P＜0.05)。TUNEL法顯示正常組、假手術(shù)組和缺血再灌注PPTA組耳蝸各部位

17、沒有或僅有個(gè)別部位出現(xiàn)細(xì)胞凋亡，缺血及再灌注對(duì)照組耳蝸凋亡細(xì)胞明顯增多，PPTA干預(yù)后凋亡細(xì)胞顯著減少。缺血再灌注組耳蝸組織Caspase-1 mRNA表達(dá)量顯著高于正常組、假手術(shù)組和缺血再灌注PPTA組(P＜0.001);缺血再灌注PPTA組耳蝸組織Caspase-1 mRNA表達(dá)量顯著高于正常組(P＜0.001);正常組和假手術(shù)組耳蝸組織Caspase-1mRNA表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.825)。
　　 結(jié)論：通過豚

18、鼠耳蝸缺血再灌注損傷模型PPTA及對(duì)照試驗(yàn)。正常組豚鼠耳蝸各部位Fas為弱陽性表達(dá)，無或罕有凋亡細(xì)胞。缺血再灌注組Fas表達(dá)增強(qiáng)，凋亡細(xì)胞增多，進(jìn)行干預(yù)后使凋亡細(xì)胞顯著減少。缺血再灌注耳蝸組織Caspase-1 mRNA的表達(dá)顯著增高，PPTA可部分但有效地降低Caspase-1 mRNA的表達(dá)。提示細(xì)胞凋亡是耳蝸缺血再灌組損傷的一種細(xì)胞損傷形式，PPTA可能通過抑制Fas蛋白及Caspase-1 mRNA的表達(dá)，通過減少細(xì)胞凋亡而對(duì)缺