人工寒潮促發(fā)腦卒中發(fā)病及其機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分人工寒潮時(shí)大鼠腦卒中發(fā)病的影響因素 背景和目的 自然寒潮由于受季節(jié)限制且每次寒潮的主要指標(biāo)很難一致，影響了結(jié)果的分析，為此我們改裝了RXZ-300A型智能人工氣候箱，按廣東省氣象局制定的寒潮標(biāo)準(zhǔn)(日平均氣溫在24小時(shí)內(nèi)急劇降溫≥8℃或48小時(shí)內(nèi)降溫≥10℃，而且過(guò)程中最低氣溫≤5℃)來(lái)實(shí)施人工寒潮，一次寒潮(22℃×24h-3℃×12h-22℃×24h)腎血管性高血壓大鼠(renovascularhyperten

2、siverats，RHR)的腦卒中發(fā)病率達(dá)16％，獲得較理想的結(jié)果。 然而，溫度變化對(duì)高血壓病相關(guān)疾病死亡的影響有明顯的滯后性和持續(xù)性，低溫的影響達(dá)到頂點(diǎn)的時(shí)間各個(gè)報(bào)道(24～54小時(shí)、6小時(shí)～5天、6～7天)不等。以往我們僅研究一天寒潮的影響未能真正反映臨床的實(shí)際情況，因此在本課題中我們?cè)谑褂酶脑斓娜斯夂蛳淠M自然寒潮的同時(shí)，延長(zhǎng)寒潮時(shí)間，考慮到人們冬天留在溫暖室內(nèi)的時(shí)間也相當(dāng)長(zhǎng)，常處于室內(nèi)外變動(dòng)中，因此本研究還采用寒冷與室

3、溫交替的方法，以期更真實(shí)地反映日常生活中寒潮對(duì)人們的影響。 本研究的目的在于尋找盡可能真實(shí)模仿自然寒潮對(duì)于腦卒中發(fā)病影響的人工寒潮處理方法，以進(jìn)一步利用此模型探討寒潮促發(fā)腦卒中發(fā)病的機(jī)制。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，還將RHR分成不同血壓水平，探討人工寒潮時(shí)不同血壓水平對(duì)腦卒中發(fā)病的影響，以了解不同水平的患病基礎(chǔ)上發(fā)病誘因所起的作用。 方法 應(yīng)用雙腎雙夾法復(fù)制RHR模型，術(shù)后12周形成穩(wěn)定高血壓后，正常血壓組與RHR組各分

4、為寒潮和非寒潮兩大組。寒潮組置于人工氣候箱中，溫度設(shè)置以22℃12小時(shí)，4℃12小時(shí)為1天循環(huán)，共3天。非寒潮組置于溫度22℃的人工氣候箱共3天。正常血壓大鼠寒潮和非寒潮組各30只，160mmHg～199mmHgRHR、200mmHg～219mmHgRHR、≥220mmHgRHR各50只。在人工氣候箱處理前后測(cè)量體重、血壓，以寒潮3天、出現(xiàn)偏癱癥狀或意識(shí)障礙、死亡為研究終點(diǎn)，在研究終點(diǎn)將大鼠斷頭取腦，先肉眼觀察出血情況，再用三苯唑氯化物

5、(triphenyltetrazoliumchloride，TTC)染色觀察梗死情況，然后取連續(xù)石蠟切片，HE染色確定腦卒中情況。 結(jié)果 除160～199mmHg組外，正常大鼠與其余血壓亞組的RHR經(jīng)寒潮后體重均減輕，血壓越高者經(jīng)寒潮后體重減輕越明顯。正常鼠經(jīng)人工氣候箱處理(寒潮或非寒潮)后血壓均升高，160～199mmHgRHR經(jīng)人工氣候箱非寒潮處理后血壓也有所升高，RHR經(jīng)寒潮后血壓均較寒潮前降低，血壓較高(200～

6、219mmHg、≥220mmHg)者即使未經(jīng)寒潮血壓也較寒潮前降低。 寒潮組RHR的腦卒中發(fā)生率為29.3％，非寒潮組RHR的腦卒中發(fā)生率為17.3％，兩者有顯著性差異(P＜0.05)。病灶分布在皮質(zhì)或皮質(zhì)下白質(zhì)的病灶占91.7％，以枕頂區(qū)多見(jiàn)，額葉未見(jiàn)病灶。 腦出血發(fā)生率明顯高于腦梗死、混合性中風(fēng)的發(fā)生率(P＜0.001)。血壓≥220mmHgRHR的寒潮組、非寒潮組之間的腦卒中發(fā)生率有顯著性差異(P＜0.05)，其余

7、各血壓亞組的寒潮組、非寒潮組之間的腦卒中發(fā)生率無(wú)顯著性差異。 無(wú)論寒潮或非寒潮組，血壓＜220mmHg與血壓≥220mmHgRHR的腦卒中發(fā)生率有顯著性差異(P＜0.001)。 將人工氣候箱處理前后體重、血壓以及是否經(jīng)人工氣候箱處理等5個(gè)自變量以ENTER法進(jìn)入Logistic回歸，發(fā)現(xiàn)只有寒潮前血壓是腦卒中發(fā)生的唯一獨(dú)立危險(xiǎn)因素(腦卒中發(fā)生=0.072×寒潮前血壓-12.725，P＜0.01)。 結(jié)論

8、1.寒潮雖非腦卒中的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，但在嚴(yán)重的腦血管病變(高血壓)的基礎(chǔ)上，也是一個(gè)重要的外部誘發(fā)因素。 2.本研究采用的人工寒潮方法能更好地模擬自然寒潮時(shí)臨床腦卒中的發(fā)病情況，對(duì)于進(jìn)一步研究氣象因素促發(fā)腦卒中的機(jī)制以及預(yù)防有重要意義。由于高血壓越高及經(jīng)歷寒潮而尚未發(fā)生腦卒中的大鼠越接近卒中前狀態(tài)，加上人工寒潮易于控制、量化的特點(diǎn)，本研究采用的模型是適合卒中前狀態(tài)研究的理想模型之一。 第二部分人工寒潮促發(fā)腦卒中發(fā)病的機(jī)制研

9、究 背景和目的 本研究第一部分肯定了兩個(gè)事實(shí)：1)腦血管病變必須達(dá)到一定的嚴(yán)重程度才具備易卒中的條件；2)在嚴(yán)重的腦血管病變基礎(chǔ)上，在外部因素(寒潮)的作用下，更易于促發(fā)腦卒中。當(dāng)滿(mǎn)足其中一點(diǎn)而又尚未發(fā)生腦卒中時(shí)，機(jī)體所處的狀態(tài)均可被稱(chēng)為卒中前狀態(tài)，其對(duì)于腦卒中預(yù)防是相當(dāng)重要的階段。研究卒中前狀態(tài)，第二點(diǎn)應(yīng)該更具代表性。第一點(diǎn)的相關(guān)研究已較多而全面，但關(guān)于第二點(diǎn)的研究比較缺乏，且存在一些問(wèn)題。鑒于凝血、纖溶分子及細(xì)胞粘附

10、分子與腦卒中及其危險(xiǎn)因素的密切關(guān)系，根據(jù)以往研究存在的問(wèn)題及第一部分的研究結(jié)果，第二部分將重點(diǎn)研究：1)不同血壓水平對(duì)血漿凝血酶激活的纖溶抑制物(thrombin-activatablefibrinolysisinhibitor，TAFI)、蛋白C(proteinC，PC)、vWF、凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物(thrombin-antithrombincomplexes，TAT)、纖溶酶-α2-抗纖溶酶(plasmin/α2-anti-pl

11、asmin，PAP)以及腦血管內(nèi)皮vWF、VCAM-1、ICAM-1、P-選擇素的影響；2)不同血壓水平下寒潮對(duì)以上指標(biāo)的影響。由于血壓越高，加上寒潮的影響，卒中發(fā)生率越高，因此高血壓越高及經(jīng)歷寒潮而尚未發(fā)生腦卒中的大鼠就越接近卒中前狀態(tài)，是本研究的重點(diǎn)，了解該狀態(tài)下內(nèi)皮功能的變化是國(guó)內(nèi)外的首次研究，對(duì)明確卒中前狀態(tài)的機(jī)制及進(jìn)一步指導(dǎo)腦卒中預(yù)防有重要意義。另外，本研究還比較腦卒中與非卒中大鼠的上述指標(biāo)的不同，以了解腦卒中前、后內(nèi)皮功能的

12、改變。 方法 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組方法同第一部分，各亞組12只大鼠。發(fā)生腦卒中者被剔出卒中前狀態(tài)的分析，另外補(bǔ)充處理大鼠，保證原位雜交及免疫組化每亞組各有6只無(wú)卒中大鼠。 靜脈取血抗凝，4℃離心，收集血漿，-80℃保存，ELISA或發(fā)色底物法檢測(cè)血漿vWF、TAFI、PC、TAT、PAP水平。已取血的大鼠，灌注后斷頭取腦，由嘴側(cè)至尾側(cè)每2毫米切成一冠狀薄片，嘴側(cè)2毫米腦片置于凍存管中，-80℃保存，備做實(shí)時(shí)熒光定量RT-

13、PCR。取視交叉層面作以下處理：1)每亞組6只視交叉層面連續(xù)石蠟切片，每8張取1張切片作免疫組化檢測(cè)血管內(nèi)皮的vWF、ICAM-1、VCAM-1、P-選擇素的蛋白表達(dá)，其余切片作HE染色，了解是否有卒中病灶；2)每亞組6只視交叉層面冰凍切片機(jī)連續(xù)切片，每8張取1張切片作原位雜交檢測(cè)血管內(nèi)皮的ICAM-1、VCAM-1、P-選擇素的mRNA表達(dá)，其余切片作HE染色，了解是否有卒中病灶。視交叉層面以外其它腦片連續(xù)石蠟切片，HE染色，了解是否

14、有卒中病灶。結(jié)果1.剔除腦卒中的各血壓亞組大鼠經(jīng)人工氣候箱處理后血漿vWF、TAFI、PC、TAT、PAP水平、腦血管的vWF的mRNA表達(dá)(目的片段拷貝數(shù)/GAPDH拷貝數(shù)，VWF/GAPDH)與蛋白表達(dá)、腦血管的VCAM-1、ICAM-1、P-選擇素的mRNA表達(dá)(比較原位雜交陽(yáng)性信號(hào)及實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR，目的片段拷貝數(shù)/GAPDH拷貝數(shù)，VCAM-1/GAPDH、ICAM-1/GAPDH、P-選擇素/GAPDH)與蛋白表達(dá)變

15、化趨勢(shì)一致如下： 1.1在＜220mmHg血壓組，寒潮組的血漿vWF、TAFI、PC、TAT、PAP水平、腦血管內(nèi)皮vWF、VCAM-1、ICAM-1、P-選擇素的mRNA表達(dá)與蛋白表達(dá)比非寒潮組均有升高趨勢(shì)。在≥220mmHg血壓亞組，寒潮組的上述指標(biāo)比非寒潮組均有降低趨勢(shì)。 1.2在非寒潮組，血漿vWF、TAFI、PC、TAT、PAP水平、腦血管內(nèi)皮vWF、VCAM-1、ICAM-1、P-選擇素的mRNA表達(dá)與蛋白表

16、達(dá)均隨血壓升高而升高。在寒潮組，上述指標(biāo)在血壓＜220mmHg時(shí)均隨血壓升高而升高，然而在血壓≥220mmHg時(shí)轉(zhuǎn)為降低。 2.腦卒中大鼠的血漿vWF、TAFI、PC、TAT、PAP水平及腦血管內(nèi)皮粘附分子vWF、VCAM-1、ICAM-1、P-選擇素的mRNA表達(dá)、蛋白表達(dá)均與未發(fā)生卒中者不同，腦梗死與腦出血之間的上述各種指標(biāo)的表達(dá)也不同。 結(jié)論 1.非寒潮時(shí)腦血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子的表達(dá)、凝血、纖溶功能隨血壓升