間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)再生障礙性貧血小鼠免疫調(diào)控機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景與目的
　　 間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)不僅具有支持造血功能,還具有免疫調(diào)節(jié)的特性。最近研究表明,MSCs能抑制T淋巴細(xì)胞的活化和增殖。MSCs可通過(guò)抑制IL-2、IL-15的產(chǎn)生從而抑制NK細(xì)胞活性。MSCs也可以減少DC1分泌TNF-α,而增加DC2分泌IL-10；減少T輔助細(xì)胞1(TH1)分泌IFN-γ,增加T輔助細(xì)胞2(TH2)分泌IL-4。
　　 再生障礙性貧血(

2、aplastic anemia,AA)是血液系統(tǒng)常見的疾病,發(fā)病原因十分復(fù)雜,目前認(rèn)為與造血干細(xì)胞內(nèi)在缺陷、造血微環(huán)境異常及機(jī)體免疫功能紊亂有關(guān)。研究表明細(xì)胞免疫功能異?？赡芷鹬饕饔?表現(xiàn)在T淋巴細(xì)胞亞群比例的改變,如外周血CD4+細(xì)胞比例明顯降低,CD4+/CD8+比值倒置,CD8+細(xì)胞比例明顯升高。目前普遍認(rèn)為再生障礙性貧血患者血清中的IL-2,IFN-γ,TNF-α異常增高,這些主要由活化T細(xì)胞分泌的負(fù)調(diào)控因子上調(diào)CD34+細(xì)胞

3、Fas抗原的表達(dá),而成為細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)或表達(dá)大量FasL的活化淋巴細(xì)胞的靶細(xì)胞,Fas與FasL的相互作用,使骨髓中CD34+細(xì)胞大量凋亡,是導(dǎo)致造血功能衰竭的重要因?yàn)椤?br>　　 有研究表明,再生障礙性貧血患者M(jìn)SCs相對(duì)數(shù)量及絕對(duì)數(shù)量較正常人少。臨床上也有輸注間充質(zhì)干細(xì)胞使再生障礙性貧血患者獲得了緩解,但其機(jī)制尚不清楚。因此推測(cè),再生障礙性貧血患者M(jìn)SCs數(shù)量減少不僅可能直接影響其支持造血功能,還可能使MSCs對(duì)免疫細(xì)

4、胞的抑制功能減弱,導(dǎo)致體內(nèi)T細(xì)胞和NK細(xì)胞異常活化損傷造血細(xì)胞導(dǎo)致造血功能衰竭。
　　 目前已建立了人骨髓MSCs培養(yǎng)體系,通過(guò)這些培養(yǎng)體系,使MSCs獲得了有效的分離、擴(kuò)增,甚至用于臨床。但這些培養(yǎng)體系多采用胎牛血清,而殘存的胎牛血清本身可引起嚴(yán)重的免疫反應(yīng)。在體外培養(yǎng)過(guò)程中,細(xì)胞的吞噬作用使牛血清中的蛋白分子細(xì)胞內(nèi)在化,即使通過(guò)洗滌也不能清除牛血清蛋白。Spees兒等研究指出,體外培養(yǎng)收獲108 MSCs,其殘存的胎牛血清蛋

5、白量在7-30mg之間,多次輸注時(shí)存在并發(fā)血清病的危險(xiǎn),同時(shí)存在感染病毒的可能,必然干擾治療效果及其評(píng)估。因此,優(yōu)化人骨髓MSCs的培養(yǎng)體系,避免使用異種蛋白,是開展相關(guān)細(xì)胞治療必需的基礎(chǔ)。
　　 本研究擬優(yōu)化人骨髓MSCs培養(yǎng)體系并探討人骨髓MSCs促進(jìn)再生障礙性貧血小鼠的造血功能及可能的免疫機(jī)制。
　　 方法
　　 第一部分 人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)體系的優(yōu)化
　　 在低糖DMEM培養(yǎng)基中分別加入臍血血

6、清、富血小板血漿以優(yōu)化人骨髓MSCs培養(yǎng)體系,并以胎牛血清為對(duì)比組,用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞的表面標(biāo)記,并誘導(dǎo)向成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞分化,用MTT法和細(xì)胞計(jì)數(shù)法測(cè)定比較用不同培養(yǎng)體系培養(yǎng)的人骨髓MSCs的生長(zhǎng)曲線,以求證能否用富血小板血漿優(yōu)化現(xiàn)有的人骨髓MSCs的培養(yǎng)體系。
　　 第二部分 人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)再生障礙性貧血小鼠造血功能的影響及其免疫調(diào)控機(jī)制的研究
　　 雌性BALB/c小鼠經(jīng)5Gy一次性全身照射,照射后4h內(nèi)

7、由尾靜脈注入DBA/2小鼠胸腺淋巴結(jié)細(xì)胞1×106cell/只,以制作免疫介導(dǎo)的再生障礙性貧血小鼠模型,并經(jīng)尾靜脈輸注大骨髓MSCs,檢測(cè)再生障礙性貧血小鼠的外周血白細(xì)胞、紅細(xì)胞的變化及其骨髓病理的變化,并檢測(cè)再生障礙性貧血小鼠外周血CD4+細(xì)胞、CD8+細(xì)胞、NK細(xì)胞的數(shù)量的變化,以了解人骨髓MSCs影響再生障礙性貧血小鼠造血功能的的可能的免疫調(diào)控機(jī)制。
　　 結(jié)果
　　 第一部分 在低糖DMEM的MSCs培養(yǎng)體系中,

8、用富血小板血漿代替胎牛血清可使MSCs更快生長(zhǎng)
　　 在低糖DMEM培養(yǎng)基中分別加入胎牛血清、臍血血清、富血小板血漿,均能用于人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)擴(kuò)增。分別用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞的表面標(biāo)記,其高度表達(dá)CD29、CD44分子,不表達(dá)CD34、CD45分子。并可誘導(dǎo)向成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞分化,證實(shí)為人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。MTT法和細(xì)胞計(jì)數(shù)法測(cè)定用不同培養(yǎng)體系培養(yǎng)的人骨髓MSCs的生長(zhǎng)曲線,證實(shí)用含AB型富血小板血漿的培養(yǎng)體系培養(yǎng)的人骨

9、髓MSCs生長(zhǎng)速度快于其它培養(yǎng)體系,可用AB型富血小板血漿優(yōu)化人骨髓MSCs培養(yǎng)體系。
　　 第二部分 人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可能通過(guò)調(diào)節(jié)免疫介導(dǎo)的再生障礙性貧血小鼠的免疫細(xì)胞促進(jìn)其造血
　　 經(jīng)5Gy一次性全身照射后,再障小鼠外周血象第7d開始持續(xù)性下降,至21d血象仍未恢復(fù)。輸注人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后,再障小鼠外周血象第7d開始下降,21d血象基本恢復(fù)正常。MSCs治療組小鼠股骨病理切片中脂肪細(xì)胞比例明顯低于再障模型組,與

10、單純照射組結(jié)果一致。照射后7d,各組小鼠間外周血CD4+細(xì)胞、CD8+細(xì)胞、CD4+/CD8+無(wú)明顯差異,但MSCs治療組NK細(xì)胞顯著低于單純照射組和再障模型組(P<0.01)。照射后14d三組CD4+細(xì)胞比例均明顯下降,CD8+細(xì)胞則表現(xiàn)不同,再障模型組與MSCs治療組CD8+細(xì)胞比例顯著高于單純照射組,至照射后21d,MSCs治療組CD8+、NK細(xì)胞與單純照射組相近、而模型組則顯著高于單純照射組和MSCs治療組。
　　 結(jié)論

11、
　　 1、富血小板血漿可作為動(dòng)物血清的替代物,以富血小板血漿配比低糖DMEM培養(yǎng)基優(yōu)化人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)體系。
　　 2、免疫介導(dǎo)的再生障礙性貧血小鼠模型經(jīng)輸注人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,小鼠血象至照射后14d開始上升,至21d血象基本恢復(fù)正常,骨髓增生活躍,脂肪細(xì)胞較少,提示輸注MSCs可以防止免疫介導(dǎo)再生障礙性貧血。
　　 3、輸注入骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后MSCs治療組外周血CD4+/CD8+及NK細(xì)胞接近單純照射

12、組,與再障模型組顯示出顯著的差別,提示輸注MSCs可以影響體內(nèi)免疫細(xì)胞從而影響造血功能。
　　 本研究的創(chuàng)新點(diǎn)
　　 本研究?jī)?yōu)化了人骨髓MSCs的培養(yǎng)方法,通過(guò)去除培養(yǎng)體系中的動(dòng)物血清,解決了異源性蛋白和病毒潛在感染的問(wèn)題,為臨床應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可通過(guò)免疫調(diào)控影響免疫介導(dǎo)性再生障礙性貧血小鼠的骨髓造血功能,為治療再生障礙性貧血提供了新的方法和途徑。
　　 本研究的價(jià)值
　　 本研究?jī)?yōu)化了