二氫青蒿素下調(diào)富鐵粒系白血病細胞轉(zhuǎn)鐵蛋白受體表達及抑制VEGF自分泌-旁分泌作用研究.pdf

1、鐵是機體許多代謝活動的必需元素，參與了氧的轉(zhuǎn)運和利用以及生命活動相關(guān)的多種酶的組成，在能量代謝、DNA合成以及調(diào)控細胞周期進程的因子等方面均有重要作用。研究表明，絕大多數(shù)細胞包括腫瘤細胞攝取鐵主要通過轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(transferrinreceptor,TfR)介導。由于TfR在過度增殖細胞中高表達，特別是惡性血液腫瘤細胞，因此TfR表達的調(diào)節(jié)對腫瘤細胞的增殖分化及對腫瘤診治有重要影響。 青蒿素(artemisinin)是我國科

2、學家在1971年首次從菊科植物黃花蒿(ArtemisiaannuaLinn)中提出的具有新型結(jié)構(gòu)的倍半萜內(nèi)酯，具有高效低毒的抗瘧作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)，青蒿素類藥物具有較好的體內(nèi)外抗腫瘤活性，二氫青蒿素(dihydroartemisinin，DHA)為青蒿素類藥物在體內(nèi)的主要活性代謝產(chǎn)物，與其他青蒿素類藥物相比顯示出更強的抗腫瘤活性。近年來大量研究也表明，青蒿素類藥物發(fā)揮細胞毒作用所表現(xiàn)的抗腫瘤活性與Fe2+的參與密切相關(guān)。 本課

3、題組的前期研究表明二氫青蒿素可有效抑制人卵巢癌裸鼠移植瘤組織血管內(nèi)皮生長因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)的表達，并能抑制慢性髓性白血病K562細胞和早幼粒急性髓性白血病HL60細胞增殖。而對于二氫青蒿素能否顯著下調(diào)富鐵白血病細胞TfR和VEGF表達，并進一步增強對富鐵白血病細胞增殖的抑制作用，目前尚未見報道。本文選取TfR和VEGF高表達的粒系白血病細胞株HL60和K562為研究對象，通過

4、建立常鐵HL60和K562細胞以及富鐵K562細胞體外培養(yǎng)模型，以TfR和VEGF為靶標，從細胞分子水平研究二氫青蒿素增強對富鐵K562細胞增殖抑制的可能機制，為青蒿素類藥物有可能作為一種特異的、毒性小而有效的白血病(輔助)治療藥物提供藥理學依據(jù)。 結(jié)果： 1.二氫青蒿素下調(diào)粒系白血病細胞TfR的密度實驗結(jié)果表明，二氫青蒿素能顯著降低HL60細胞和K562細胞TfR的密度，且呈濃度依賴性。二氫青蒿素0.5，1μM組顯示，

5、HL60細胞TfR的密度相對于溶劑對照組分別下降了12.0％，33.2％(P＜0.05)。二氫青蒿素5，10μM組顯示，K562細胞TfR的密度相對于溶劑對照組分別下降了31.6％，48.5％(P＜0.05)。而在富鐵培養(yǎng)條件，即細胞經(jīng)過Holotransferrin預處理1h后，再給予10μM二氫青蒿素，對K562細胞TfR密度的下降作用更強。與常鐵培養(yǎng)組比較，相同濃度二氫青蒿素對富鐵K562細胞TfR的密度下降了30.2％(P＜0.

6、05)。 2.二氫青蒿素下調(diào)粒系白血病細胞TfR的表達Westernblotting實驗表明，二氫青蒿素能顯著下調(diào)HL60細胞和K562細胞TfR蛋白的表達，且呈濃度和作用時間依賴性。HL60細胞經(jīng)不同濃度二氫青蒿素(0.25，0.5和1μM)作用48h后，隨著藥物濃度的增加，TfR蛋白的表達量遞減，與溶劑對照組相比有顯著性差異(P＜0.05)。HL60細胞經(jīng)1μM二氫青蒿素作用12h，24h，48h后，TfR蛋白的表達呈時間依

7、賴性地減弱，相對于溶劑對照組有顯著性差異(P＜0.05)。K562細胞經(jīng)10μM二氫青蒿素作用12h，24h，48h后，TfR蛋白的表達量相對于溶劑對照組分別下調(diào)了30.6％，48.1％，58.2％(P＜0.05)。10μM二氫青蒿素能顯著下調(diào)常鐵培養(yǎng)的K562細胞TfR蛋白的表達，而二氫青蒿素對富鐵K562細胞TfR蛋白表達的下調(diào)作用更強。與常鐵培養(yǎng)組比較，相同濃度二氫青蒿素對富鐵K562細胞TfR蛋白表達量下調(diào)了28.1％，統(tǒng)計學上

8、有顯著性差異(P＜0.01)。 RT-PCR結(jié)果顯示，10μM二氫青蒿素能顯著抑制TfRmRNA的表達，而二氫青蒿素對富鐵K562細胞TfRmRNA表達的抑制作用更強。與常鐵培養(yǎng)組比較，相同濃度二氫青蒿素對富鐵K562細胞TfRmRNA表達量下調(diào)了26.2％(P＜0.05)。 3.二氫青蒿素下降粒系白血病K562細胞鐵的含量原子分光光度法結(jié)果表明，二氫青蒿素能顯著下降K562細胞鐵的含量，且呈濃度依賴性(P＜0.05)。

9、10μM二氫青蒿素能顯著減少常鐵培養(yǎng)的K562細胞鐵的含量，而二氫青蒿素對富鐵K562細胞鐵含量的下降作用更強。與常鐵培養(yǎng)組比較，相同濃度二氫青蒿素對富鐵K562細胞鐵含量下降了28.8％(P＜0.05)。 4二氫青蒿素抑制富鐵K562細胞VEGF的表達及其誘導的血管新生RT-PCR結(jié)果顯示，10μM二氫青蒿素能顯著抑制VEGFmRNA的表達，而二氫青蒿素對富鐵K562細胞VEGFmRNA表達的抑制作用更強。與常鐵培養(yǎng)組比較，相

10、同濃度二氫青蒿素對富鐵K562細胞VEGFmRNA表達量下調(diào)了16.4％(P＞0.05)。 Westernblotting結(jié)果顯示，10μM二氫青蒿素能顯著下調(diào)常鐵培養(yǎng)的K562細胞VEGF蛋白的表達，而二氫青蒿素對富鐵K562細胞VEGF蛋白表達的下調(diào)作用更強。與常鐵培養(yǎng)組比較，相同濃度二氫青蒿素對富鐵K562細胞VEGF蛋白表達量下調(diào)了36.3％(P＜0.01)。 ELISA結(jié)果顯示，5μM二氫青蒿素即能顯著下調(diào)常鐵

11、培養(yǎng)的K562細胞條件培養(yǎng)基(CM)中VEGF蛋白的分泌，而二氫青蒿素對富鐵K562細胞CM中VEGF蛋白分泌的下調(diào)作用更強。與常鐵培養(yǎng)組比較，10μM二氫青蒿素對富鐵K562細胞CM中VEGF蛋白分泌量下調(diào)了68.7％(P＜0.001)。 CAM實驗表明，與DMSO溶劑組相比，2.5，5和10μM二氫青蒿素預處理細胞的CM，對CAM血管新生的促進能力分別下降了28.2，44.2and56.7％；而經(jīng)二氫青蒿素預處理的富鐵K56

12、2細胞CM，對CAM血管生成的促進能力更顯著降低，其中經(jīng)10μM二氫青蒿素預處理的富鐵K562細胞CM，其促CAM血管生成的能力相比于經(jīng)相同濃度二氫青蒿素預處理的富鐵K562細胞CM下降了23.8％(P＜0.05)。 5二氫青蒿素抑制粒系白血病細胞增殖實驗結(jié)果表明，二氫青蒿素能有效抑制HL60細胞和K562細胞的增殖，且呈濃度和作用時間依賴性。經(jīng)二氫青蒿素作用48h后，對HL60細胞的IC50值為1.74μM，95％置信區(qū)間分別

13、為0.86-2.601μM，對K562細胞的IC50值為11.33μM，95％置信區(qū)間為9.38-13.68μM。 Holotransferrin對K562細胞增殖具有促進作用，在Holotransferrin作用濃度20nM時增殖能力達到峰值。經(jīng)量效分析，經(jīng)Holotransferrin預處理使細胞呈富鐵狀態(tài)，1h后再加入不同濃度的二氫青蒿素，對K562細胞抑制作用明顯增強，其IC50值為3.67μM，是對常鐵K562細胞抑制

14、作用的3.1倍。經(jīng)時效分析，10μM二氫青蒿素作用富鐵K562細胞36h后，存活的細胞數(shù)為常鐵培養(yǎng)組的38.9％，作用48h后降為25.0％。 6TfR與VEGF表達的相關(guān)性分析綜合以上實驗結(jié)果分析，在常鐵和富鐵K562細胞中，高表達的TfR蛋白與VEGF蛋白表達成正相關(guān)(r=0.902，P＜0.01)；在RT-PCR實驗中也得到了一致的結(jié)果(r=0.671，P＜0.05)。此外，ELISA實驗也表明，TfR表達與VEGF蛋白分

15、泌之間存在著顯著的相關(guān)性(r=0.846，P＜0.01)；而TfR蛋白與mRNA表達與K562細胞誘導的血管生成也成正相關(guān)(r=0.916，P＜0.01；r=0.860，P＜0.01)。 以上研究結(jié)果表明： (1)二氫青蒿素能顯著的降低K562細胞鐵的含量，能更有效的抑制富鐵K562細胞的增殖； (2)二氫青蒿素能更顯著下調(diào)富鐵粒系白血病K562細胞TfR密度和TfR蛋白、mRNA的表達； (3)二氫青蒿