荔枝核、莨芀花和羅浮粗葉木抗鴨乙肝病毒及護(hù)肝作用的實(shí)驗(yàn)性研究.pdf

1、為探討中草藥治療乙型肝炎的新方法，我們用自己建立的廣西麻鴨乙肝感染模型，對(duì)荔枝核、茛芀花和羅浮粗葉三種中藥材的抗病毒及護(hù)肝作用進(jìn)行了評(píng)價(jià)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高劑量荔枝核水提物能明顯抑制鴨乙型肝炎病毒的復(fù)制，而荔枝核醇提物和低劑量荔枝核水提物沒(méi)有明顯抑制鴨乙型肝炎病毒的作用;荔枝核水提物和醇提物降低AST和ALT活性均不明顯。茛芀花醇提取物和羅浮粗葉木提取物均未見(jiàn)有抑制鴨乙肝病毒復(fù)制的作用。高劑量茛芀花醇提物對(duì)鴨乙肝病毒引起的肝損傷具有一定的保護(hù)

2、作用。羅浮粗葉木提取物對(duì)鴨乙肝病毒引起的肝損傷保護(hù)作用不明顯。
　　第一部分荔枝核抗鴨乙肝病毒及護(hù)肝作用的實(shí)驗(yàn)性研究
　　目的:乙型肝炎是我國(guó)最常見(jiàn)的傳染病之一，嚴(yán)重危害人民的生命和健康。荔枝是廣西最常見(jiàn)的水果之一，本研究擬探討荔枝核提取物對(duì)鴨乙型肝炎病毒的療效，評(píng)價(jià)其將來(lái)作為治療人乙型肝炎的可能性。
　　方法:
　　1、用蒸餾水和95％乙醇提取物對(duì)荔枝核分別進(jìn)行水提和醇提。2、建立鴨乙型肝炎病毒DNA熒光定量P

3、CR檢測(cè)方法，并評(píng)估檢測(cè)值和鴨乙型肝炎病毒DNA的敏感性，特異性，重復(fù)性，線性度和線性范圍。3、鴨子乙肝動(dòng)物模型的建立:將乙型肝炎病毒DNA陽(yáng)性血清0.15毫升注入每只1日齡雛鴨的腹腔。采用分層隨機(jī)抽樣方法，將人工感染乙型肝炎病毒的動(dòng)物隨機(jī)分配到六組。五個(gè)治療組分別給予高劑量(1.4g/kg)荔枝水提取物，低劑量荔枝核水提取物(0.35g/kg)，高劑量的荔枝核醇提取物（0.7克/千克·天），低劑量荔枝核乙醇提取物（0.18g/kg日）

4、和陽(yáng)性對(duì)照藥物阿昔洛韋(ACV)，模型對(duì)照組（給蒸餾水）。觀察治療前和治療后5天，10天及停藥后4天實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血清中乙型肝炎病毒的DNA，ALT和AST水平的動(dòng)態(tài)變化，并最終進(jìn)行動(dòng)物肝臟病理檢查。對(duì)DHBV DNA和ALT和AST的測(cè)試數(shù)據(jù)，使用使用重復(fù)測(cè)量資料方差法分析法，而用于判斷肝臟疾病嚴(yán)重程度的數(shù)據(jù)，則應(yīng)用列聯(lián)表卡方檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)處理和分析使用Windows統(tǒng)計(jì)軟件SPSS11.5軟件。
　　結(jié)果:
　　1、熒

5、光定量PCR檢測(cè)乙型肝炎病毒DNA的方法，該方法具有敏感性好，特異性高，重復(fù)性好，線性范圍廣泛的優(yōu)勢(shì)。檢測(cè)下限在6.93×103至6.93×102拷貝之間;
　　2、雛鴨感染HBV后14天內(nèi)，乙型肝炎病毒DNA顯示隨著時(shí)間的推移呈下降趨勢(shì)。阿昔洛韋組和高劑量的荔枝水提取物組，相比模型對(duì)照組，治療后乙型肝炎病毒DNA的水平明顯下降，表明ACV和高劑量的荔枝核水提取物能抑制乙型肝炎病毒復(fù)制，其余治療組與對(duì)照組無(wú)顯著性差異。高劑量的荔枝

6、核水提取物，其抑制病毒效果和ACV類似，但阿昔洛韋治療組在停藥四天后病毒載量大幅反彈，而高劑量的荔枝核水提物組反彈并不明顯。
　　3、經(jīng)過(guò)治療，高劑量水提取物組ALT活性水平比對(duì)照組動(dòng)物低，但由于整個(gè)觀察期間的六組動(dòng)物的的ALT均在正常范圍內(nèi)。因此，不能認(rèn)為是高劑量的荔枝核水提取物能顯著降低ALT活性。其余治療組和模型對(duì)照組比較，ALT活性變化趨勢(shì)差異不顯著。6組動(dòng)物的AST活性也基本上在正常范圍內(nèi)，并且AST的變化在各組差異不顯

7、著，因此也基本可以認(rèn)為藥物降低AST活性不明顯。
　　4、肝臟病理檢查發(fā)現(xiàn)，在六組動(dòng)物肝臟疾病的嚴(yán)重程度無(wú)顯著性差異。表明荔枝核提取物可能沒(méi)有保護(hù)肝組織的作用。
　　結(jié)論:
　　高劑量的荔枝水提取物能顯著抑制鴨乙型肝炎病毒，而荔枝醇提取物（不管是高劑量還是低劑量）及低劑量荔枝水提取物沒(méi)有顯著抑制鴨乙型肝炎病毒的作用;未能證實(shí)荔枝核水提取物和乙醇提取物可降低ALT和AST水平，病理學(xué)檢查也未發(fā)現(xiàn)荔枝核的護(hù)肝功能。

8、　　第二部分茛芀花抗鴨乙肝病毒作用的實(shí)驗(yàn)性研究
　　目的:茛芀花是一種非常重要的藥用紅樹(shù)植物，在中國(guó)民間當(dāng)中常將搗碎的茛艿花根與蜂蜜混合后服用，以便對(duì)乙型肝炎進(jìn)行治療。但有關(guān)茛芀花的確切臨床療效如何尚未有科學(xué)評(píng)價(jià)，其抗乙肝病毒效果也未見(jiàn)的有相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究報(bào)道。本研究旨在用自己建立的鴨乙肝動(dòng)物模型來(lái)評(píng)價(jià)茛芀花的抗病毒作用和護(hù)肝效果。
　　方法:(1)茛芀花乙醇提取物制備:用70％的乙醇浸泡茛芀花。Bliss法測(cè)定急性毒性，計(jì)算

9、LD50。(2)觀察茛芀花乙醇提取物的抗鴨子乙型肝炎病毒的作用:經(jīng)過(guò)強(qiáng)陽(yáng)性鴨子乙型肝炎病毒DNA血清0.2毫升在腹腔注射1日齡雛鴨，15天后篩選出DHBV陽(yáng)性鴨（用FQ-PCR檢測(cè)方法），建立人工鴨乙型肝炎病毒感染動(dòng)物模型。采用分層隨機(jī)抽樣方法，將人工感染乙型肝炎病毒的動(dòng)物，隨機(jī)分成五組。四個(gè)治療組分別給予茛芀花高劑量乙醇提取物(2.0g/kg)，茛芀花中劑量組乙醇提取物(1.0g/kg)，茛芀花低劑量乙醇提取物（0.5克/千克·天）和

10、陽(yáng)性對(duì)照藥物阿昔洛韋(ACV)治療，另外設(shè)一組模型對(duì)照組（不給藥物，給蒸餾水）和一個(gè)正常對(duì)照組（PCR檢測(cè)乙型肝炎病毒陰性鴨作為正常對(duì)照組，灌服雙蒸水）。每組12只動(dòng)物，各組雛鴨灌服藥物14天。于治療前(T0)和治療后7天(T7)，治療后14天(T14)，停藥后5天(P5)收集血液樣本，用FQ-PCR法檢測(cè)血清中鴨乙型肝炎病毒DNA含量，酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定血清DHBsAg，DHBeAg0D值，同時(shí)檢測(cè)血清轉(zhuǎn)氨酶(ALT，AST)，停藥后

11、處死動(dòng)物，做肝臟病理檢查。(3)數(shù)據(jù)分析:鴨乙型肝炎病毒DNA，DHBsAg和DHBeAg，ALT和AST數(shù)據(jù)采用重復(fù)測(cè)量的方差方法分析，藥物對(duì)鴨肝臟病理的保護(hù)效果選用次和經(jīng)驗(yàn)分析。數(shù)據(jù)處理和分析采用SPSS13.0和PEM3.1統(tǒng)計(jì)軟件。
　　結(jié)果:
　　1.急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，茛芀花對(duì)小鼠的LD50為20.04g/kg。95％可信區(qū)間17.66～22.74g/kg，表明茛芀花乙醇提取物處于一種無(wú)毒的級(jí)別。
　　2

12、.茛芀花乙醇提取物對(duì)鴨乙型肝炎病毒(DHBV)的抑制作用:
　　(1)治療后，血清鴨乙型肝炎病毒DNA水平僅ACV組比模型對(duì)照組顯著降低(P＜0.01)，茛芀花的的三個(gè)劑量組與模型組均無(wú)顯著性差異，表明茛芀花乙醇提取物沒(méi)有直接抑制乙型肝炎病毒的作用。
　　(2)治療后，治療組與模型組相比，血清DHBsAg，在DHBeAg OD值差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。茛芀花乙醇提取物沒(méi)有降低血清DHBsAg和DHBeAg活性的作

13、用。
　　(3)治療后，在降低ALT活性的功能方面，阿昔洛韋、中劑量和高劑量組的茛芀花乙醇提取物，比模型對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);還發(fā)現(xiàn)，在降低AST方面，阿昔洛韋和茛芀花高劑量醇提取物較模型對(duì)照組功能要強(qiáng)(P＜0.01)。這些結(jié)果表明，ACV和茛芀花的乙醇提取物能降低血清ALT，AST水平，改善肝功能，這些功能的大小和茛芀花酒精提取物劑量及用藥時(shí)間長(zhǎng)短有關(guān)。
　　(4)肝臟病理檢查發(fā)現(xiàn)，高劑量組的茛艿花提取物

14、和阿昔洛韋對(duì)乙型肝炎病毒引起的肝損傷的有明顯的保護(hù)作用(P＜0.01);其余治療組與模型組比較，無(wú)顯著性差異。
　　結(jié)論:
　　(1)提取的茛芀花酒精提取物的LD50為20.04g/kg，處于無(wú)毒級(jí)。
　　(2)茛芀花乙醇提取物對(duì)鴨乙型肝炎病毒引起肝功能損害具有明顯的保肝作用，作用大小具有劑量相關(guān)性。沒(méi)有發(fā)現(xiàn)茛芀花乙醇提取物有抑制乙型肝炎病毒的作用。
　　第三部分羅浮粗葉木抗鴨乙肝病毒及其護(hù)肝作用的實(shí)驗(yàn)性研究

15、r>　　目的:
　　羅浮粗葉木在福建、廣東等民間被廣泛用于治療病毒性肝炎的治療，但其治療效果如何，沒(méi)有嚴(yán)格科學(xué)意義上的臨床評(píng)價(jià)，也沒(méi)有這種藥材的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)治療效果評(píng)價(jià)。因此，本研究旨在利用我們自己建立的廣西麻鴨乙型肝炎病毒感染模型，對(duì)羅浮粗葉木醇提取物治療效果包括抗病毒效果和護(hù)肝效果兩個(gè)方面進(jìn)行評(píng)價(jià)。
　　方法:
　　羅浮粗葉木醇提物的制備:用70％乙醇提取。急性毒性試驗(yàn):為了計(jì)算動(dòng)物實(shí)驗(yàn)所需要的藥物劑量，我們采用改良孫

16、氏寇氏法測(cè)定毒性并計(jì)算半數(shù)致死量LD50。病毒接種及治療觀察:用0.2m1DHBV DNA強(qiáng)陽(yáng)性血清，注射至剛孵化1日的雛鴨腹腔，15天后采血用熒光定量PCR篩選出DHBV強(qiáng)陽(yáng)性鴨子，建立人工感染鴨HBV的動(dòng)物模型。將人工感染DHBV的雛鴨隨機(jī)分配到5個(gè)組。其中4個(gè)組給予治療分別是高劑醇提物組（2.86g/kg·日）、中劑量醇提物組（1.43g/kg·日）、低劑量醇提物組（0.72g/kg·日）和陽(yáng)性對(duì)照藥物阿昔洛韋(ACV)治療組，另

17、設(shè)1組模型對(duì)照，以雙蒸水代替藥物。再另設(shè)1組正常動(dòng)物組(DHBV陰性)，也給予等量的雙蒸水。每組12只動(dòng)物，各組雛鴨均灌胃14天。于灌藥前(T0)、灌藥后7天(T7)、灌藥后14天(T14)、停藥后5天(P5)分別采血，采用熒光定量PCR方法檢測(cè)血清中DHBV DNA的載量，用ELISA法測(cè)定DHBsAg的0D值，同時(shí)檢測(cè)血清中的轉(zhuǎn)氨酶(AST，ALT)，最后處死動(dòng)物，做肝臟病理學(xué)檢查。數(shù)據(jù)分析:采用重復(fù)測(cè)量資料方差分析方法，分析DHB

18、VDNA、DHBsAg、 ALT與AST的有關(guān)檢測(cè)數(shù)據(jù)，藥物對(duì)鴨肝病理影響的數(shù)據(jù)，則采用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)處理分析均采用SPSS13.0 forwindows統(tǒng)計(jì)軟件。
　　結(jié)果:
　　研究過(guò)程中僅ACV組的病毒載量低于模型組（P=0.043），提示ACV能抑制DHBV的復(fù)制，但從14天開(kāi)始到停藥5天，DHBV載量出現(xiàn)反跳。比較各治療組與模型組病毒載量，發(fā)現(xiàn)它們隨時(shí)間變化的趨勢(shì)都比較相近，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）

19、，羅浮粗葉木醇提物高、中、低三個(gè)劑量的治療組，都未顯示出明顯的抑制DHBV的作用。本實(shí)驗(yàn)中1.2kg羅浮粗葉木生藥制得醇提物3029，經(jīng)口急性毒性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其對(duì)小鼠的LD50為22.91g/kg，95％可信區(qū)間處于21.41～24.51g/kg之間（孫氏改良寇氏法），屬于無(wú)毒級(jí)。觀察期內(nèi)，正常動(dòng)物組的鴨乙肝表面抗原OD值明顯低于治療組及模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;各治療組與模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說(shuō)明本

20、實(shí)驗(yàn)中羅浮粗葉木醇提物的三個(gè)劑量組，都沒(méi)有抑制鴨乙肝表面抗原表達(dá)的作用。觀察期內(nèi)，各個(gè)時(shí)點(diǎn)治療組及模型組的ALT和AST數(shù)值均明顯高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);各治療組與模型組比較，差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提示羅浮粗葉木醇提物的高中低三個(gè)劑量，都沒(méi)有降低ALT、AST水平以及改善肝功能的作用。肝臟病理檢查發(fā)現(xiàn)，三個(gè)劑量醇提物治療組的肝組織病變并沒(méi)有明顯改善（比較模型組，P＞0.05），提示羅浮粗葉木沒(méi)有保護(hù)作