PPARγ2轉(zhuǎn)錄因子與Ⅱ型原發(fā)性骨質(zhì)疏松關(guān)系的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、近年來，隨著對(duì)調(diào)控脂肪細(xì)胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子—過氧化物酶體增殖物激活受體γ2(PPARγ2)研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)其在骨代謝過程中可能扮演著關(guān)鍵的角色。由于脂肪細(xì)胞與成骨細(xì)胞有著共同的起源即骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)，在髓腔中這兩種細(xì)胞的數(shù)量存在“此消彼長”的關(guān)系，且臨床發(fā)現(xiàn)各種骨質(zhì)疏松均伴隨脂肪髓的發(fā)生，因而骨髓細(xì)胞PPARγ2基因活化與骨代謝的關(guān)系日益受到人們重視。 研究表明，隨年齡增長骨髓MSCs成脂分化的潛能增加，調(diào)控這

2、一過程的PPARγ2與成骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Cbfα1之間存在交互作用，MSCs向脂肪細(xì)胞分化的同時(shí)抑制Cbfα1mRNA的表達(dá)從而使成骨細(xì)胞生成減少，影響骨形成，這可能是年齡相關(guān)的骨質(zhì)疏松與脂骨發(fā)生的原因之一。介導(dǎo)骨吸收的破骨細(xì)胞來源于表達(dá)PPARγ2的骨髓造血干細(xì)胞(HSCs)，而配體激活PPARγ2轉(zhuǎn)錄活性對(duì)破骨細(xì)胞分化及活化的影響目前仍有爭議，PPARγ2是否參與調(diào)控骨吸收過程值得進(jìn)一步研究。 目前，關(guān)于髓腔脂肪細(xì)胞

3、的增多是否與增齡過程中PPARγ2的內(nèi)源性配體增多有關(guān)尚未明確，其次，作為2型糖尿病治療一線藥物廣泛應(yīng)用于臨床的PPARγ2人工合成配體噻唑烷二酮類藥物(TZDs)是否存在骨代謝的負(fù)效應(yīng)也逐漸引起人們的關(guān)注。對(duì)此，國外相關(guān)的研究日漸增多，而國內(nèi)尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)PPARγ2的內(nèi)源性配體Ox-LDL與增齡骨量丟失的關(guān)系、人工合成配體鹽酸吡格列酮在體內(nèi)及體外對(duì)破骨細(xì)胞分化及活化的影響的研究，探討PPARγ2基因在Ⅱ型原發(fā)性骨質(zhì)疏松發(fā)生

4、中的可能作用及其作用機(jī)制，期望為骨質(zhì)疏松的治療提供新的思路，為TZDs臨床用藥的安全性提供理論指導(dǎo)。 一、內(nèi)源配體激活PPARγ2與Ⅱ型原發(fā)性骨質(zhì)疏松關(guān)系的實(shí)驗(yàn)研究目的：觀察自然增齡大鼠骨髓細(xì)胞PPARγ2表達(dá)與Ox-LDL及骨量的關(guān)系，探討PPARγ2基因在Ⅱ型原發(fā)性骨質(zhì)疏松發(fā)生過程中可能的作用機(jī)制。 方法：選擇增齡過程中不同年齡段雄性Wistar大鼠(6、12及18月齡)作為研究對(duì)象，采用RT-PCR檢測其骨髓細(xì)胞P

5、PARγ2、破骨細(xì)胞分化相關(guān)基因RNAKL、OPG、RANKmRNA表達(dá)水平，雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清及骨髓上清Ox-LDL水平，用圖象分析儀測定不同年齡段大鼠骨髓脂肪組織含量并對(duì)其與股骨骨密度進(jìn)行相關(guān)性分析，同時(shí)測定血清及骨髓上清液骨形成指標(biāo)ALP的活性、骨吸收指標(biāo)TRAP活性及脂肪生成指標(biāo)aP2水平的變化。 結(jié)果：1)大鼠股骨骨密度及骨礦物含量隨增齡呈進(jìn)行性減低，骨密度各組組間比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01，P＜0.

6、05)；骨組織HE染色可見6月齡大鼠髓腔中脂肪組織極少，而18月齡組脂肪含量幾乎占據(jù)40％髓腔空間，各組組間比較差異顯著(P＜0.01)，脂肪髓的發(fā)生與年齡呈正相關(guān)，與骨密度呈負(fù)相關(guān)。 2)血清及骨髓上清液相關(guān)指標(biāo)變化趨勢(shì)相同：ALP活性隨增齡進(jìn)行性降低，18與6、12月齡組相比差異顯著(P＜0.01，P＜0.05)；TRAP活性在18月齡組明顯增高，與另兩組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01，P＜0.05)，而6、12月齡組之間無

7、明顯變化；aP2在增齡過程中逐漸增高，三組相比差異顯著(P＜0.01)。 3)半定量RT-PCR分析顯示PPARγ2表達(dá)隨年齡增加明顯升高，三組差異顯著(P＜0.05，P＜0.01)；破骨細(xì)胞分化相關(guān)基因RANKL表達(dá)隨增齡呈進(jìn)行性升高，而OPG表達(dá)在12、18月齡組明顯下降，各組組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01，P＜0.05)，RANK表達(dá)水平隨增齡無明顯變化。 4)Ox-LDL在血清及骨髓中的濃度隨增齡均呈明顯增高

8、的趨勢(shì)，三組組間比較差異顯著(P＜0.01，P＜0.05)。 結(jié)論：隨年齡增長機(jī)體Ox-LDL水平升高可激活骨髓細(xì)胞PPARγ2的轉(zhuǎn)錄活性，引起骨髓脂肪生成增多并通過調(diào)節(jié)骨髓微環(huán)境中細(xì)胞因子RANKL與OPG比值參與骨量減低的發(fā)生，是Ⅱ型原發(fā)性骨質(zhì)疏松發(fā)生的可能機(jī)制之一。 二、外源配體激活PPARγ2對(duì)破骨細(xì)胞及大鼠骨量的影響分題一、破骨細(xì)胞體外培養(yǎng)體系的選擇及確立 目的：研究不同培養(yǎng)方法對(duì)大鼠骨髓破骨細(xì)胞樣細(xì)胞

9、(OLC)分化及活性的影響。 方法：以M-CSF及RANKL協(xié)同作用于4-6周齡大鼠骨髓細(xì)胞誘導(dǎo)OLC的分化，比較全骨髓細(xì)胞培養(yǎng)法(A組)及M-CSF擴(kuò)增骨髓單個(gè)核細(xì)胞及貼壁細(xì)胞去除法(B組)的差異。應(yīng)用RT-PCR分析培養(yǎng)3、5及7d兩組OLCRNAKmRNA的表達(dá)水平，結(jié)合細(xì)胞染色、TRAP活性觀察兩組OLC分化的差異；通過骨吸收陷窩分析及流式細(xì)胞儀(FCM)檢測OLC膜整合素β3(CD61)表達(dá)量比較兩組OLC活性的差異。

10、 結(jié)果：B組培養(yǎng)5d、7dTRAP染色陽性O(shè)LC數(shù)量多于A組，組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，TRAP活性變化趨勢(shì)亦然(P＜0.01，P＜0.05)，RANKmRNA表達(dá)兩組無明顯區(qū)別；培養(yǎng)5、7d的牙本質(zhì)片上骨吸收陷窩數(shù)及陷窩面積B組較A組多(P＜0.05)(P＜0.01)；CD61表達(dá)量及平均熒光強(qiáng)度零天及3d時(shí)點(diǎn)B組均較A組明顯增高(P＜0.01，P＜0.05)，但隨培養(yǎng)時(shí)間延長組間比較無顯著差異。 結(jié)論：采

11、用經(jīng)M-CSF擴(kuò)增的非黏附骨髓單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行OLC誘導(dǎo)分化，獲得的OLC數(shù)量較多且不影響其活性，是一種簡便有效的體外破骨細(xì)胞培養(yǎng)方法。 分題二、體外實(shí)驗(yàn)：吡格列酮對(duì)大鼠破骨樣細(xì)胞分化及活性的影響 目的：觀察吡格列酮對(duì)培養(yǎng)的大鼠OLC分化及活性的影響，探討PPARγ2活化與破骨細(xì)胞之間的關(guān)系。 方法：用RANKL及M-CSF協(xié)同誘導(dǎo)大鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞向OLC分化，同時(shí)加入不同濃度的鹽酸吡格列酮(終濃度0、1μM、5

12、μM、10μM)干預(yù)。應(yīng)用半定量RT-PCR分析OLC分化過程中PPARγ2、RANKmRNA的表達(dá)，結(jié)合各組細(xì)胞染色及TRAP活性觀察吡格列酮對(duì)OLC分化的影響；通過各組骨吸收陷窩分析及FCM檢測CD61表達(dá)量比較不同濃度吡格列酮對(duì)OLC活性的影響。 結(jié)果：1)對(duì)OLC分化的影響：培養(yǎng)7d時(shí)吡格列酮10μM組與對(duì)照組、1μM及5μM組相比OLC數(shù)量及TRAP活性明顯減少，組間比較差異顯著(P＜0.01，P＜0.05)，而另兩組

13、干預(yù)組與對(duì)照組相比無顯著差異，表明吡格列酮部分抑制OLC分化且此作用與劑量相關(guān)；RT-PCR結(jié)果顯示在誘導(dǎo)分化早期，不同濃度吡格列酮呈劑量依賴性上調(diào)PPARγ2的表達(dá)水平，但隨OLC的增殖及成熟其表達(dá)漸減弱，而RANK表達(dá)在吡格列酮5μM及10μM干預(yù)組培養(yǎng)的各時(shí)間點(diǎn)均明顯下調(diào)，與對(duì)照及1μM干預(yù)組相比有顯著差異(P＜0.05，P＜0.01)，結(jié)合吡格列酮10μM組與對(duì)照組培養(yǎng)3、5及7天細(xì)胞爬片染色結(jié)果表明吡格列酮對(duì)OLC分化的抑制作