VEGF-C、VEGF-B和TIAM-1在胃癌中的表達及相關(guān)性的研究.pdf

1、研究背景和目的
　　 胃癌是世界范圍內(nèi)第四位的惡性腫瘤，繼肺癌之后占據(jù)全世界惡性腫瘤死亡率的第二位。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致胃癌治療失敗和患者死亡的主要原因，是胃癌最強烈的預(yù)后因素。大約60％的可切除胃癌在診斷之時已經(jīng)發(fā)生了淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，因此進展期胃癌總的五年生存率不足20％。因此，預(yù)測腫瘤轉(zhuǎn)移傾向、判斷腫瘤預(yù)后的標(biāo)志物，尋找預(yù)防和治療的有效途徑，提高病人的5年生存率，降低死亡率是胃癌研究的重點內(nèi)容，也是腫瘤防治研究中的一個重點和難點。<

2、br>　　 腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移有賴于血管新生，促進血管新生的關(guān)鍵因子是血管內(nèi)皮生長因子家族成員（vascular endothelial growth factor family VEGFs）。 VEGFs包括VEGF-A、B、C、D、E和PIGF（placenta growth factor，胎盤生長因子）。近年來，許多文獻報道了血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)在多種惡性腫瘤中異常表達，并與腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移及預(yù)后相關(guān)。其中VEGF-B及其

3、受體Flt-1的表達已見于人神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、乳腺癌、腎癌、大腸癌、肺癌等，與大腸癌和肺癌的淋巴浸潤和淋巴轉(zhuǎn)移密切相關(guān);可以調(diào)節(jié)腎癌中腫瘤血管的形成;在惡性的神膠質(zhì)瘤血管生成過程中，可能作為輔助因子而發(fā)揮作用;在乳腺癌中其主要作用不是促進血管形成，而是與淋巴轉(zhuǎn)移密切相關(guān),目前對于抗VEGF受體的治療，為乳腺癌的治療提供新的途徑。但VEGF-B及其受體在胃癌中的表達及意義尚未見于報道。
　　 血管內(nèi)皮生長因子C（vascular en

4、dothelial growth factor C，VEGF-C）及其受體血管內(nèi)皮生長因子受體-3(vascular endothelial growth factor receptor-3，VEGFR-3)，亦稱Flt-4，是近年來發(fā)現(xiàn)的淋巴管生長因子，研究認為VEGF-C是相對特異的淋巴管內(nèi)皮生長因子，與VEGFR-3結(jié)合后可發(fā)生淋巴管內(nèi)皮擴張，促使淋巴管形成，從而為研究淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移機制開辟了新的途徑。血管內(nèi)皮生長因子C與其受體VEG

5、FR-3結(jié)合后，具有強大特異的淋巴管生成作用，并認為與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系。
　　 T淋巴瘤侵襲轉(zhuǎn)移誘導(dǎo)因子1(T lymphoma invasion and metastasis1，Tiam-1)基因是Db1家族的鳥嘌呤核酸轉(zhuǎn)換因子（guanine nucleotide exchange factor, GEFs）之一，GEFs主要功能是調(diào)節(jié)Rho三磷酸鳥嘌呤核苷酸水解酶(Rho GTPases)家族活性，是普遍存在的二

6、磷酸鳥嘌呤核苷酸(GDP)與三磷酸鳥嘌呤核苷酸(GTP)轉(zhuǎn)換因子，通過參與Tiam1-Rac信號傳遞通路調(diào)節(jié)細胞骨架重組、細胞周期進程、基因轉(zhuǎn)錄、細胞遷移和粘附等細胞生命活動，在腫瘤增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。早期研究表明Tiam-1是誘導(dǎo)人類T細胞淋巴瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的基因。Tiam1基因最初在小鼠T淋巴瘤細胞高侵襲變異株中分離鑒定。隨后，在乳腺癌、胃癌及Ras誘導(dǎo)的皮膚癌等腫瘤證實Tiam1具有明顯的促進腫瘤進展和轉(zhuǎn)移的作用。在

7、Tiam-1敲除的動物模型中，小鼠皮膚癌發(fā)生率明顯減低并且腫瘤進展緩慢，Malliri等認為Tiam-1在Ras誘導(dǎo)皮膚癌發(fā)生的啟動和進展階段發(fā)揮關(guān)鍵作用，這一效應(yīng)與Tiam-1表達量有明顯的關(guān)系。上述的研究表明，Tiam-1是多種腫瘤的促癌基因和促轉(zhuǎn)移基因。
　　 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是胃癌患者預(yù)后的十分重要的不良因素，其診斷尤為重要。而目前主要的臨床診斷手段卻對胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在與否的預(yù)測缺乏特異性和敏感性。盡管常規(guī)病理HE染色對于淋

8、巴結(jié)轉(zhuǎn)移是金標(biāo)準(zhǔn)，但是，對于早期的淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移卻缺乏敏感性，對胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)實驗研究則可能有助于我們找到解決問題的金鑰匙。VEGF-C作為調(diào)控淋巴管發(fā)育及淋巴管生成的特異因子及其與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性在動物實驗及臨床病理實驗中已經(jīng)得到證實。并且Tiam-1被認為是多種腫瘤的促癌基因和促轉(zhuǎn)移基因，這可能對于胃癌患者早期診斷、準(zhǔn)確分期、改善手術(shù)方式和術(shù)后治療方案，甚至研制相關(guān)新藥，促進腫瘤治療進展將具有重大意義。但兩者的相關(guān)性及在外周血

9、中的表達與轉(zhuǎn)移的相關(guān)性尚沒有明確研究。本研究通過實時熒光定量RT-PCR、免疫組化和酶聯(lián)免疫法檢測外周血及病理組織中VEGF-C和Tiam-1的表達和基因水平變化，結(jié)合臨床病理資料進行統(tǒng)計分析，旨在探討VEGF-C和Tiam-1的表達和基因水平變化及其相關(guān)性與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的相關(guān)性，以及在胃癌患者腫瘤組織和外周血中的表達有無相關(guān)性，明確能否用外周血中的表達水平來預(yù)測腫瘤組織中的表達，尋找一種更簡便的檢測方法，并研究VEGF

10、-C和Tiam-1的表達水平和腫瘤治療及預(yù)后之間的關(guān)系，分析其作為腫瘤標(biāo)記物的意義。
　　 研究方法
　　 1.臨床病理參數(shù)采集:采集研究對象年齡、性別、腫瘤直徑、TNM分期、血管浸潤、漿膜浸潤、淋巴管浸潤資料信息。
　　 2.血清中VEGF-B、VEGF-C水平的檢測:ELISA檢測試劑盒檢測正常人群、胃癌患者術(shù)前術(shù)后及隨訪患者血清蛋白水平。
　　 3.病理組織中VEGF-B、 VEGF-C和Tiam-

11、1蛋白/基因水平的檢測：應(yīng)用免疫組化技術(shù)、Westem blotting和熒光定量PCR檢測胃癌標(biāo)本、淋巴結(jié)及距病灶約3.5cm的癌旁正常胃粘膜組織中VEGF-B、VEGF-C和Tiam-1蛋白表達和基因水平變化。
　　 4.統(tǒng)計分析：應(yīng)用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，采用x2檢驗分析VEGF-B、VEGF-C和Tiam-1蛋白/基因水平與各臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系;采用Spearman相關(guān)分析VEGF-C和Tiam-1蛋白

12、/基因水平相關(guān)性;采用Kaplan-Meier法回顧性分析VEGF-C和Tiam-1蛋白表達及基因水平與胃癌患者生存期的關(guān)系;以COX回歸對各項指標(biāo)單因素或多變量聯(lián)合與生存期的關(guān)系進行統(tǒng)計學(xué)分析。
　　 研究結(jié)果
　　 1.胃癌患者術(shù)前血清VEGF-C水平較對照組血清VEGF-C升高，差異具有顯著意義(P＜0.01)。胃癌術(shù)后患者血清VEGF-C水平與術(shù)前相應(yīng)指標(biāo)比較，差異具有顯著性(P＜0.05)。但胃癌手術(shù)后血清VE

13、GF-C水平與健康對照組相比，無明顯差異(P＞0.05)。VEGF-B在術(shù)前術(shù)后胃癌患者血清中無明顯變化。
　　 2.復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組的血清VEGF-C水平較未復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的血清VEGF-C水平升高，兩組相比，差異具有顯著性(P＜0.05)。復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組與對照組間的比較，差異具有顯著性(P＜0.05)。對照組和無復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組間的比較，無顯著差異。VEGF-B在復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組與對照組間的比較無明顯差異。
　　 3.胃癌患者血清VEGF-C水

14、平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤漿膜及臨床分期有關(guān)，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組、未侵潤漿膜組、TNMⅠ期組及高中分化組患者血清VEGF-C水平均明顯低于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，浸潤漿膜組、TNMⅡⅢⅣ期及低分化未分化組(均P＜0.05)，VEGF-B關(guān)系不明顯。
　　 4.VEGF-C和Tiam-1蛋白主要表達于胃癌組織原發(fā)灶及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的癌細胞的胞漿或/和胞膜上，伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌的VEGF-C和Tiam-1表達的陽性率明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌的陽性率，差

15、異具有顯著性(P＜0.05)。胃癌患者癌組織中VEGF-C和Tiam-1蛋白與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤漿膜及臨床分期有關(guān)，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組、未侵潤漿膜組、TNMⅠⅡ期組患者癌組織中VEGF-C和Tiam-1蛋白均明顯低于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，浸潤漿膜組、TNMⅢⅣ期組(均p＜0.05)，
　　 5.實時熒光定量RT-PCR結(jié)果顯示，正常胃粘膜組織與各實驗組胃癌組織及淋巴結(jié)組織的VEGF-C和Tiam-1基因水平差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);V

16、EGF-C、Tiam-1 mRNA相對含量與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期密切相關(guān)，在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNMⅢⅣ期的癌組織中，VEGF-C、Tiam-1 mRNA相對含量較沒有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNMⅠⅡ期的癌組織中顯著增高(P＜0.01)，并且淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移越遠，VEGF-C、Tiam-1 mRNA含量增高越明顯(P＜0.01)。
　　 6.Spearman相關(guān)分析顯示VEGF-C和Tiam-1在胃癌中的表達成正相關(guān)(r=0.567，P＜0.01)

17、，且兩者的表達水平均隨胃癌組織分化程度降低、浸潤深度增加、TNM分期升高及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生而逐漸增強(P＜0.05)。
　　 7.Kaplan-Meier生存曲線顯示，VEGF-C和Tiam-1表達陽性患者與未表達患者患者生存時間有顯著性差異(P＜0.05)。將VEGF-C和Tiam-1表達水平和臨床病理參數(shù)綜合與胃癌患者的生存時間進行單因素分析，結(jié)果顯示VEGF-C在癌組織中高表達和Tiam-1在淋巴結(jié)中高表達、腫瘤分期是影響

18、患者生存時間的重要因素(P值分別為：0.003、0.007、0.028)。
　　 結(jié)論
　　 1.血清VEGF-C水平的檢測可作為胃癌的血清學(xué)標(biāo)記物，對篩選胃癌及觀察胃癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移具有一定的臨床意義。
　　 2.VEGF-B在胃癌組織有一定的表達，但與胃癌的各病理參數(shù)無相關(guān)性。
　　 3.VEGF-C和Tiam-1在胃癌組織中及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中高表達，在正常組織中不表達，提示VEGF-B、VEGF-C和TIAM

19、-1可作為臨床監(jiān)測胃癌轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的重要標(biāo)志物;
　　 4.VEGF-C和Tiam-1的表達強度與胃癌病理分期關(guān)系密切，其表達水平可作為判斷胃癌侵襲性的參考指標(biāo)之一。
　　 5.VEGF-C和Tiam-1高表達與患者的生存期密切相關(guān)，提示VEGF-C和Tiam-1可作為胃癌預(yù)后判斷的重要指標(biāo)，對判斷胃癌預(yù)后有重要意義。
　　 6.VEGF-C和Tiam-1有一定的相關(guān)性，說明兩者在促進腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移中具有一定