siRNA抑制HO-1表達(dá)以治療新生期高膽紅素血癥的研究.pdf

1、新生兒黃疸是新生兒期臨床常見(jiàn)病癥，由膽紅素產(chǎn)生和排泄失衡所致，發(fā)生率較高，約占新生兒的2/3。膽紅素對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)有損害，嚴(yán)重黃疸者可引起膽紅素中毒性腦病，約占新生兒黃疸的0.5～2％，造成兒童智力障礙甚至死亡，有很高的致死率或致殘率。 血紅素加氧酶（Heme Oxygenase，HO）是血紅素代謝為膽紅素的限速酶，其中HO-1 可被多種因素誘導(dǎo)。本課題先通過(guò)RNA干擾技術(shù)在體外BRL細(xì)胞水平特異下調(diào)HO-1基因的表達(dá)，探討通過(guò)降低

2、HO-1表達(dá)以阻斷膽紅素產(chǎn)生；然后用有效的siRNA注射新生鼠黃疸模型降低膽紅素生成，以期尋找出一條新的早期防治新生兒高膽紅素血癥及膽紅素中毒性腦病新的有效途徑。 針對(duì)大鼠HO-1基因設(shè)計(jì)并化學(xué)合成四組小分子干擾RNA（smallinterfering RNA，siRNA）。用INTERFERin轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染FAM標(biāo)記的siRNA，流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率可達(dá)90％。通過(guò)RT-PCR篩選出具最佳抑制效果的序列——siRNA-4，1

3、0nM siRNA轉(zhuǎn)染24h 后RT-PCR檢測(cè)抑制效率77％；siRNA-1、2也有一定程度的抑制。siRNA-4對(duì)于HO-1基因的最佳作用濃度為10nM，mRNA水平抑制最佳作用時(shí)間為24h。體外經(jīng)濃度梯度、時(shí)間梯度檢測(cè)證實(shí)3μg/mL血紅素刺激，就能誘導(dǎo)HO-1高表達(dá)，18h誘導(dǎo)效果最好。siRNA-4亦可降低被誘導(dǎo)HO-1蛋白表達(dá)，實(shí)驗(yàn)證實(shí)最佳作用時(shí)間36h，抑制效率可達(dá)64％。我們通過(guò)對(duì)7～10天齡SD大鼠3次腹腔注射50 μ

4、M/（100 g 體重）ALA能誘導(dǎo)HO-1表達(dá)和血清膽紅素生成，HO-1升高到原來(lái)3倍，總膽、直膽。間膽濃度都升高，依此構(gòu)建新生鼠黃疸模型。此模型大鼠經(jīng)腹腔注射半甲氧基修飾的siRNA-4，實(shí)驗(yàn)證實(shí)5 OD/（20 g 體重）劑量siRNA-4注射2d后對(duì)總膽紅素抑制效率43％，10 OD/（20g體重）抑制效率50％；HO-1蛋白抑制效率各為30％和42％。5 OD/（20 g體重）劑量注射時(shí)，最后一次注射后1天、2天、3天總膽紅素