蒜氨酸-蒜酶二元釋藥體系相關(guān)研究.pdf

1、目的：本研究按照國家標(biāo)準(zhǔn)委的要求建立了蒜氨酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值方法。國際上公認(rèn)的大蒜的主要功效成分是蒜酶（EC4.1.1.4）催化蒜氨酸產(chǎn)生的大蒜辣素及其他大蒜所特有的含硫化合物。為了提高蒜酶的反應(yīng)效率，本研究采用光纖傳感過程分析技術(shù)研究蒜氨酸/蒜酶催化動力學(xué)?；谒獍彼?蒜酶催化動力學(xué)原理及二元釋藥系統(tǒng)研究思路，研制了蒜氨酸/蒜酶腸溶片，為了有效控制其質(zhì)量，本研究建立了蒜氨酸/蒜酶腸溶片有效的質(zhì)量控制方法。為闡明其作用過程和機理，本研究于體

2、外對蒜氨酸在大鼠血液中的分布進(jìn)行研究。
　　方法：1.應(yīng)用高效液相色譜面積歸一化法確定蒜氨酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的純度。對樣品進(jìn)行均勻性檢驗及長期穩(wěn)定性檢驗，以此為基礎(chǔ)采取9個實驗室協(xié)作定值的方法對樣品進(jìn)行檢測定值。2.采用光纖傳感過程分析技術(shù)研究蒜氨酸/蒜酶催化動力學(xué)，根據(jù)朗伯—比爾定律，建立了兩種數(shù)學(xué)模型，一種是測定反應(yīng)中各物質(zhì)的吸光系數(shù)，另一種是將產(chǎn)物看作整體。根據(jù)紫外光譜，確定檢測波長及探頭規(guī)格，進(jìn)一步測定各參數(shù)值。將參數(shù)錄入工作站，

3、系列濃度蒜氨酸與固定濃度蒜酶以體積比1:1進(jìn)行混合反應(yīng)，動態(tài)監(jiān)測蒜氨酸濃度變化。導(dǎo)出數(shù)據(jù)，經(jīng)Origin7.5軟件及雙倒數(shù)法處理最終求得催化動力學(xué)參數(shù)Km及νmax。所測結(jié)果同HPLC方法求得的值進(jìn)行比較。3.采用 TLC法對蒜氨酸/蒜酶腸溶片中的蒜氨酸、潛在大蒜辣素進(jìn)行定性鑒別；參照中國藥典2010版，采用籃法檢查制劑的體外釋放度；采用HPLC法對制劑中的蒜氨酸、潛在大蒜辣素進(jìn)行含量測定。4.采用鄰苯二甲醛為柱前衍生化試劑，結(jié)合反相高

4、效液相色譜建立血漿樣品中蒜氨酸含量測定方法。分別用超濾法及微透析法測定蒜氨酸與大鼠體外血漿蛋白結(jié)合率，評價體內(nèi)微透析取樣的可行性。蒜氨酸加入大鼠血液中，經(jīng)孵育后，分別測定全血、血漿及血細(xì)胞中蒜氨酸的含量，考察蒜氨酸在血液中的分布情況。
　　結(jié)果：1.均勻性檢驗數(shù)據(jù)經(jīng)F檢驗，樣品均勻性良好。長期穩(wěn)定性檢驗數(shù)據(jù)經(jīng)t檢驗，表明在4℃條件下蒜氨酸至少穩(wěn)定43個月。最終定值結(jié)果由標(biāo)準(zhǔn)值和不確定度表示為（99.5±0.95）％。2.檢測波長為

5、230nm，探頭規(guī)格為5mm。建立的數(shù)學(xué)模型可以有效地獲取蒜氨酸/蒜酶催化反應(yīng)過程曲線。3種方法Km值無顯著性差異，HPLC方法測得的νmax同數(shù)學(xué)模型測定結(jié)果有顯著性差異。3.薄層色譜中蒜氨酸、潛在大蒜辣素特征斑點清晰；制劑在pH1.0鹽酸溶液中2h未檢出大蒜辣素，在pH6.8的磷酸鹽緩沖液中開始釋放，2h的累計釋放度達(dá)70%以上；二批樣品含蒜氨酸分別為51.58mg/片、55.24mg/片，含大蒜辣素分別為13.73mg/片、21.

6、08mg/片。輔料在整個研究中不干擾測定。4.經(jīng)系統(tǒng)的方法學(xué)考察，所建立的含量測定方法具有較好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。超濾法與微透析方法測定的蛋白結(jié)合率無顯著性差異，且與濃度呈依賴關(guān)系。血漿及血細(xì)胞中均有蒜氨酸分布，且血漿中的濃度較高；全血中濃度較加入量有所降低。
　　結(jié)論：1.研制的蒜氨酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)通過了國家標(biāo)準(zhǔn)委的審評并獲得蒜氨酸國家標(biāo)準(zhǔn)樣品證書，填補了國內(nèi)空白。2.蒜氨酸/蒜酶系統(tǒng)催化反應(yīng)很快，采用光纖傳感過程分析技術(shù)實時監(jiān)測催化反