Profilin-1在自發(fā)性高血壓大鼠心肌肥大中的作用及機制研究.pdf

1、第一部分:自發(fā)性高血壓大鼠心肌肥大的定量比較蛋白質組學研究
　　研究背景:
　　心肌肥大是心肌細胞和細胞外間質對血流動力學超負荷和神經體液失調等多種病理刺激的基本應答和代償反應，是許多心血管疾病（如高血壓、心臟瓣膜病、急性心肌梗塞和先天性心臟?。┌l(fā)生發(fā)展過程中共有的病理變化。臨床流行病學資料顯示，心肌肥大導致心源性猝死和心力衰竭的發(fā)病率明顯增高，嚴重影響患者的預后，已被列為影響心血管疾病發(fā)病率和死亡率的獨立危險因子。因此，對

2、心肌肥大發(fā)生機制的探討并尋找有效的預防和治療措施，具有十分深遠的臨床意義和科研價值。
　　蛋白質組學是以蛋白質組為研究對象，探究細胞內所有蛋白質及其動態(tài)變化規(guī)律的科學，在細胞和生命有機體的整體水平上闡明生命現(xiàn)象的本質和活動規(guī)律。同位素標記的相對和絕對定量技術(isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ)是近年來開發(fā)的一種新的比較蛋白質組學定量研究技術。iTR

3、AQ技術可對一個基因組表達的全部蛋白質進行精確定量和鑒定，尋找差異表達蛋白，并分析其蛋白功能。與傳統(tǒng)的依賴凝膠電泳的定量技術相比，iTRAQ是基于高度敏感性和精確性的串聯(lián)質譜方法;可同時對4種甚至8種不同來源的樣品進行絕對和相對定量研究;不僅可以發(fā)現(xiàn)胞漿蛋白，還可發(fā)現(xiàn)膜蛋白、核蛋白甚至胞外蛋白;可以檢測出低豐度蛋白、強堿性蛋白、小于10kD或大于200kD的蛋白。iTRAQ技術的發(fā)展為探討心肌肥大的發(fā)生機制，尋找關鍵的作用蛋白提供了高效

4、可靠的研究方法。
　　自發(fā)性高血壓大鼠(Spontaneous Hypertension Rat，SHR)是1959年由日本京都大學Okamoto和Aoki培育而成的遺傳性高血壓動物模型。SHR在遺傳特性、發(fā)病機制以及高血壓心血管并發(fā)癥等方面均與人類原發(fā)性高血壓十分相似，是目前國際公認最接近于人類原發(fā)性高血壓的動物模型。心肌肥大是SHR重要特征之一，高血壓性心肌肥大在幼年SHR已出現(xiàn)，并存在于高血壓整個自然病程中。
　　因此

5、，本研究選用特定年齡階段的SHR大鼠為研究對象，采用定量比較蛋白質組學iTRAQ技術，著力于發(fā)現(xiàn)SHR大鼠早期心肌肥大發(fā)生發(fā)展過程中差異表達的功能性蛋白或蛋白群，并利用生物信息學方法分析差異蛋白的分子功能、蛋白分類及生物學過程，篩選并鑒定在高血壓性心肌肥大發(fā)病過程中起關鍵作用的蛋白分子，為高血壓心肌肥大的防治提供有效靶點。
　　研究目的:
　　1.研究自發(fā)性高血壓大鼠心肌病變的特點，觀察5周齡和17周齡SHR大鼠心肌組織的病

6、理學和超微結構變化;
　　2.應用iTRAQ蛋白質組學技術研究SHR大鼠肥大心肌與同周齡WKY大鼠正常心肌組織的差異表達蛋白，從整體水平上揭示高血壓心肌肥大病變的病理生理機制，并篩選關鍵靶蛋白;
　　研究方法:
　　4周齡雄性SHR大鼠8只，WKY大鼠8只，16周齡雄性SHR大鼠8只，WKY大鼠8只，適應性飼養(yǎng)1周后（即5周齡和17周齡時）進入實驗:
　　1.大鼠尾動脈收縮壓測定:處死前通過無創(chuàng)血壓測量系統(tǒng)檢測各

7、組大鼠尾動脈收縮壓;
　　2.心臟質量指數(shù)測定:大鼠處死后，稱量心臟重和左室重，測量主動脈瓣至心尖的距離為左心室長軸。以左室重/心臟重和左心室長軸作為反應心室肥大的指標;
　　3.心肌組織病理學檢測:HE染色觀察心肌組織病理變化，天狼星紅染色測定膠原纖維面積百分比;
　　4.心肌組織超微結構觀察:透射電鏡技術觀察心肌肌絲、肌節(jié)、線粒體及細胞核等亞細胞結構;
　　5.蛋白質組學(iTRAQ)分析:5周齡WKY大鼠（

8、WKY-5）、5周齡SHR大鼠（SHR-5）、17周齡WKY大鼠（WKY-17）和17周齡SHR大鼠（SHR-17）各8只，提取左心室總蛋白。采用胰酶消化蛋白得到肽段，按照ABI公司說明書操作標記肽段，114標記WKY-5組，115標記SHR-5組，116標記WKY-17組，117標記SHR-17組。將各組已標記的肽段混合后用強陽離子交換柱和C18柱進行分離，然后采用MALDI-TOF/TOF和MicroQ-TOF進行質譜鑒定。不同報告

9、基團離子的強度代表其所標記的多肽的相對豐度;
　　6.差異蛋白質功能分析:利用Data Analysis4.0軟件分析質譜數(shù)據(jù)，用Mascot軟件搜索與質譜匹配的蛋白。采用 Panther軟件(http://www.pantherdb.org/)對差異蛋白進行GO分析，包括分子功能，生物過程和細胞組成三個部分;
　　7.驗證profilin-1的表達:采用實時定量聚合酶鏈反應(qPCR)技術檢測各組大鼠心肌組織中profil

10、in-1的mRNA水平，蛋白質免疫印跡方法(Western blot)檢測profilin-1的蛋白表達水平，以驗證蛋白質組學的可靠性。
　　研究結果:
　　1.大鼠尾動脈收縮壓:5周齡WKY大鼠收縮壓為111.2±7.6mmHg，5周齡SHR大鼠收縮壓為143.1±10.5mmHg，已顯著升高(P＜0.001)，17周齡WKY大鼠收縮壓為117.7±8.6mmHg，17周齡SHR大鼠收縮壓為216.3±12.1mmHg，收

11、縮壓的差異更為顯著(P＜0.001)。
　　2.大鼠心臟肥大指數(shù):5周齡SHR大鼠的平均LVW/HW比值為0.55±0.02，5周齡WKY大鼠的平均LVW/HW比值為0.54±0.02，兩者無顯著差異;17周齡SHR大鼠的平均LVW/HW比值為0.77±0.06，同周齡WKY大鼠的平均LVW/HW比值為0.60±0.03，SHR大鼠較WKY大鼠升高28.33％。5周齡SHR大鼠的左室長軸平均長度為6.45±0.33mm，同周齡WK

12、Y大鼠的左室長軸平均長度為6.42±0.36mm，兩者無顯著差異;17周齡SHR大鼠的左室長軸平均長度為13.31±0.67mm，同周齡WKY大鼠的左室長軸平均長度為9.97±0.60mm，SHR大鼠較WKY大鼠升高33.50％。
　　3.大鼠心肌病理學分析
　　3.1、心肌HE染色:5周齡及17周齡的WKY大鼠心肌細胞形態(tài)正常，排列整齊、致密，肌纖維無斷裂，橫紋、閏盤及細胞核染色清晰;5周齡SHR大鼠心肌細胞形態(tài)、結構及排

13、列基本正常;17周齡SHR大鼠心肌細胞腫脹、內容物成顆粒狀，部分細胞間排列稀疏、間隙不清，心肌纖維斷裂、融合呈波浪狀改變，多數(shù)橫紋、閏盤尚清晰，細胞核肥大或固縮，個別視野心肌間質纖維化;橫截面上可見心肌細胞直徑增寬，單個心肌細胞面積明顯增加。
　　3.2、心肌天狼星紅染色:WKY大鼠心肌間質幾乎無膠原纖維分布，對40個隨機視野分析后得到其天狼星紅染色陽性區(qū)域約占視野下總面積的0.13±0.01％(5周齡)和0.18±0.02％（1

14、7周齡）;5周齡SHR大鼠心肌膠原纖維占視野下總面積的0.15±0.01％，與同周齡WKY大鼠相比無顯著差異;17周齡SHR大鼠心肌膠原分布較同周齡WKY大鼠明顯增多，約占總面積的2.93±0.26％(P＜0.001)。
　　4.大鼠心肌超微結構觀察:電鏡下可見5周齡和17周齡WKY大鼠心肌組織中，肌原纖維含量豐富，排列規(guī)整，Z線和明暗帶清晰;閏盤結構正常;線粒體沿肌原纖維長軸平行排列，可見均勻的基質顆粒和完整致密的線粒體嵴;細胞

15、核為圓形或橢圓形，核染色質均勻，核仁清晰，核膜平滑完整。5周齡SHR大鼠心肌細胞超微結構尚未出現(xiàn)典型的心肌肥大表現(xiàn)，但肌原纖維排列已出現(xiàn)紊亂，部分區(qū)域肌絲溶解，肌小節(jié)結構破壞，Z線斷裂成波浪狀;線粒體數(shù)量略增多，排布出現(xiàn)不規(guī)整;細胞核及其他細胞器形態(tài)基本正常。17周齡SHR大鼠心肌細胞內肌原纖維排列紊亂，肌小節(jié)結構破壞，Z線斷裂成波浪狀，部分區(qū)域肌絲溶解消失而被增生的線粒體取代;線粒體形態(tài)異常，數(shù)量增多且排布紊亂，部分線粒體腫脹，因基質

16、顆粒的缺失出現(xiàn)了電子透亮區(qū)，線粒體嵴模糊不清;細胞核肥大、畸形，核膜呈不規(guī)則凹陷，染色質聚集成小團塊，在核膜內側尤為顯著，核仁較為明顯;粗面內質網(wǎng)和高爾基體發(fā)達，提示合成分泌功能旺盛，符合心肌肥厚表現(xiàn)。
　　5.質譜分析結果:實驗共鑒定出大鼠心肌蛋白506個，5周齡SHR大鼠與WKY大鼠相比差異表達蛋白共7個，其中上調3個，下調4個;17周齡SHR大鼠與WKY大鼠相比差異表達蛋白28個，其中上調17個，下調11個。進一步分析發(fā)現(xiàn)，

17、5周齡和17周齡WKY與SHR兩組中共同的差異蛋白有3個，分別是:Profilin-1、Myosin light chain kinase 2和Mitochondrial NADP+-isocitrate dehydrogenase。
　　6.SHR大鼠肥大心肌差異蛋白的功能分析:根據(jù)分子功能注釋，差異蛋白主要執(zhí)行結構性分子功能(36.7％)，結合功能(30.0％)和催化功能(20.0％)。根據(jù)生物過程注釋，差異蛋白主要參與細胞過

18、程(18.0％)、代謝過程(16.0％)、生長發(fā)育(14.0％)及生物合成(14.0％)4種生物過程。根據(jù)細胞成分注釋，主要包含細胞組成(47.6％)、細胞器(42.9％)、細胞膜(4.8％)及細胞連接(4.8％)四部分。Panther蛋白種類分析顯示差異蛋白主要包含細胞骨架蛋白(33.3％)、酶調節(jié)蛋白(13.3％)、結構蛋白(10.0％)和氧化還原蛋白(6.7％)等，細胞骨架蛋白占據(jù)的高比例（三分之一）與前面結構性分子功能(36.7

19、％)相呼應，可見細胞骨架蛋白在SHR大鼠心肌肥大病理過程中占據(jù)重要地位。
　　7.實時定量PCR檢測Profilin-1的mRNA表達:5周齡SHR大鼠profilin-1mRNA表達水平為同周齡WKY大鼠的1.86倍，表達明顯上調(P＜0.001);17周齡SHR大鼠profilin-1mRNA表達水平為同周齡WKY大鼠的2.83倍，表達上調具有顯著的統(tǒng)計學差異(P＜0.001)。實時定量PCR結果與iTRAQ研究結果一致。

20、r>　　8.Western Blot檢測Profilin-1的蛋白表達:與同周齡WKY大鼠相比，5周齡SHR大鼠心肌組織profilin-1的蛋白水平上調了約23.33％，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);17周齡SHR大鼠心肌組織profilin-1的蛋白水平較同周齡WKY大鼠上調了約64.10％，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。Westem-blot結果與比較蛋白質組學研究結果一致。
　　結論：
　　1.心臟質量指

21、數(shù)、心肌病理學分析以及超微結構觀察結果均證實17周齡SHR大鼠心肌肥大模型已構建成功，5周齡SHR大鼠心肌出現(xiàn)早期病理改變，尚未發(fā)生心肌肥大。
　　2.作為定量比較蛋白質組學的新技術iTRAQ具有較好的精確性、重復性和定量效果，可用于研究SHR大鼠心肌肥大的分子機制，找到該發(fā)病過程的關鍵蛋白及通路。
　　3.質譜鑒定17周齡SHR大鼠肥大心肌與同周齡WKY大鼠正常心肌的差異表達蛋白28個，其中上調17個，下調11個，經GO分

22、析后發(fā)現(xiàn)細胞骨架蛋白在SHR大鼠心肌肥大病理過程中占據(jù)重要地位。
　　4.實時定量PCR及Western blot實驗結果均證實SHR大鼠心肌組織中profilin-1的表達水平明顯上調，這一方面驗證了iTRAQ技術的可靠性，同時為深入研究高血壓誘導的心肌肥大的發(fā)病機制提供了關鍵的候選靶點。
　　第二部分：profilin-1在高血壓大鼠心肌肥大中的作用及機制研究
　　研究背景：
　　高血壓是心肌肥大的首要致病因

23、素，患者的心臟處于血流動力學超負荷狀態(tài)時，心肌細胞可感知該種牽張刺激，產生、釋放多種細胞因子，這些細胞因子與心肌細胞膜上的相應受體結合后激活多種肥大相關信號級聯(lián)反應，隨后誘導核內原癌基因的轉錄活化，啟動心肌細胞的肥大反應過程。胞膜的功能蛋白、細胞骨架系統(tǒng)和細胞因子間的相互作用共同參與了這一病理生理過程，其中細胞骨架系統(tǒng)是感知力學刺激、將機械應力轉化為生化信號的關鍵組件，研究細胞骨架，尤其是肌動蛋白微絲系統(tǒng)，是深入認識血流動力學超負荷誘導

24、下心肌肥大發(fā)生機制的重要切入點。
　　Profilin-1是一種重要的肌動蛋白結合蛋白，可受細胞外信號影響而調節(jié)肌動蛋白細胞骨架的動態(tài)組裝。課題組前期研究提示profilin-1在哇巴因高血壓大鼠心肌肥大早期發(fā)揮關鍵作用，且第一部分的蛋白質組學結果揭示自發(fā)性高血壓大鼠早期肥大心肌中profilin-1的表達較對照組顯著升高。因此，本課題將利用自發(fā)性高血壓大鼠心肌肥大模型，構建腺病毒表達載體，誘導心肌細胞中profilin-1基因的

25、過表達和沉默，綜合運用各種病理學組織學染色技術和分子生物學技術研究profilin-1在高血壓心肌肥厚病變發(fā)生發(fā)展中的作用及其可能機制。這些結果將為高血壓心肌肥大患者的早期防治提供新靶點，具有重要的學術理論意義和潛在的臨床應用價值。
　　研究目的：
　　1.自發(fā)性高血壓心肌肥大模型大鼠體內轉染高表達腺病毒載體pAd-profilin-1-IRES-EGFP或干擾腺病毒載體pAd-miR-profilin-1，觀察對心肌肥大病

26、變的影響;
　　2.在組織病理學水平、細胞分子水平和超微結構水平研究profilin-1參與高血壓心肌肥大發(fā)生發(fā)展的機制;
　　研究方法：
　　1.5周齡自發(fā)性高血壓大鼠60只，隨機分為SHR-C組、SHR-I組和SHR-H組;5周齡健康WKY大鼠20只作為對照組WKY-C組。SHR-C組與WKY-C組大鼠經尾靜脈注射陰性對照腺病毒載體3×109PFU/只，SHR-I組大鼠經尾靜脈注射干擾腺病毒載體pAd-miR-pr

27、ofilin-13×109PFU/只，SHR-H組大鼠經尾靜脈注射高表達腺病毒載體pAd-profilin-1-IRES-EGFP3×109PFU/只。6周后補充注射一次，劑量同第一次，第二次腺病毒注射6周后處死動物留取標本;
　　2.大鼠尾動脈收縮壓監(jiān)測:實驗開始前（5周齡）及腺病毒轉染后每周末通過大鼠尾動脈血壓測量儀監(jiān)測大鼠尾動脈收縮壓，觀察profilin-1過表達和沉默后對自發(fā)性高血壓大鼠血壓的影響;
　　3.心臟質

28、量指數(shù)測定:大鼠處死后，稱量心臟重和左室重，測量主動脈瓣至心尖的距離為左心室長軸。左室與心臟的重量比和左心室長軸均可作為反應心室肥大的指標;
　　4.腺病毒轉染效率檢測:第二次注射腺病毒后10天，取心肌標本切冰凍切片，熒光顯微鏡下觀察EGFP綠色熒光并拍照，利用Image-ProPlus6.0軟件檢測每個視野下EGFP綠色熒光細胞占所有心肌細胞的比例，該比值反應腺病毒轉染效率;
　　5.病理學檢測:對大鼠心肌組織分別進行HE

29、染色和天狼星紅染色，觀察腺病毒轉染后各組大鼠心肌組織病理改變;
　　6.心肌組織超微結構觀察:透射電鏡技術觀察心肌肌絲、肌節(jié)、線粒體及小窩等亞細胞結構;
　　7.免疫組織化學染色和免疫熒光染色:應用免疫組織化學染色觀察profilin-1在心肌中的定位，免疫熒光染色觀察小窩蛋白-3與肌動蛋白微絲的共定位;
　　8.大鼠血清和心肌組織中NO含量測定:應用NO測定試劑盒檢測大鼠血清和心肌組織勻漿中NO的含量;
　　9

30、.實時定量PCR檢測:取大鼠心肌組織，Trizol法提取RNA，實時熒光定量RT-PCR技術檢測profilin-1、eNOS、小窩蛋白-3mRNA相對表達量;
　　10.Western blot檢測:取大鼠心肌組織，提取蛋白，Western blot檢測profilin-1，eNOS，p-eNOS和小窩蛋白-3的蛋白表達量。
　　研究結果：
　　1.各組大鼠血壓變化:整個實驗過程中（5周齡-17周齡）SHR大鼠血壓隨

31、周齡增加而升高，且顯著高于同周齡WKY大鼠血壓;實驗末，與SHR-C組相比，SHR-I組血壓略下降，差異無統(tǒng)計學意義;與SHR-C組相比，SHR-H組血壓略升高，差異無統(tǒng)計學意義。提示profilin-1過表達和沉默對SHR大鼠血壓無明顯影響。
　　2.心臟質量指數(shù)測定:與WKY-C組大鼠相比，SHR-C組大鼠左室重量/心臟重量、左室長軸均明顯增加，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);與SHR-C組大鼠相比，SHR-I組大鼠左室重

32、量/心臟重量(P＜0.05)、左室長軸(P＜0.01)均明顯減小，而SHR-H組大鼠左室重量/心臟重量、左室長軸均明顯增加(P＜0.05)。profilin-1過表達加重SHR大鼠心肌肥大，同時profilin-1基因沉默顯著減輕了SHR大鼠心肌肥大。
　　3.腺病毒轉染效率檢測:采用天空藍染色屏蔽自發(fā)熒光后，各組大鼠心肌組織中綠色熒光細胞占細胞總數(shù)的30％～35％，注射生理鹽水的WKY大鼠和SHR大鼠心肌組織中檢測不到綠色熒光細

33、胞。
　　4.心肌組織病理學分析
　　4.1、心肌HE染色:與WKY大鼠相比，SHR大鼠心肌細胞腫脹，部分細胞間排列稀疏、間隙不清，心肌纖維斷裂、融合呈波浪狀改變;與SHR-C組大鼠相比，SHR-H組大鼠的心肌細胞腫脹更加明顯，部分心肌呈灶狀與片狀壞死，伴有脂肪變性和炎性細胞浸潤。相反，SHR-I組大鼠心肌細胞的病理損傷明顯減輕。
　　4.2、心肌天狼星紅染色:與WKY-C組大鼠相比，SHR-C組大鼠心肌膠原分布明顯增

34、多，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.001);與SHR-C組大鼠相比，SHR-H組大鼠心肌膠原分布明顯增多(P＜0.001)，而SHR-I組大鼠心肌膠原分布明顯減少(P＜0.001)。這些結果表明profilin-1基因的高表達促進高血壓誘導的心肌纖維化，而profilin-1基因沉默則有助于減輕心肌纖維化程度。
　　5.心肌超微結構觀察:與WKY-C組大鼠相比，SHR-C組大鼠心肌細胞內肌原纖維排列紊亂，肌小節(jié)結構浪狀破壞，Z線斷裂

35、成波，線粒體形態(tài)異常，數(shù)量增多且排布紊亂，線粒體嵴模糊不清，粗面內質網(wǎng)和高爾基體發(fā)達，提示合成分泌功能旺盛，符合心肌肥厚表現(xiàn);與SHR-C組相比，SHR-H組大鼠心肌超微結構破壞更為嚴重，大片區(qū)域肌原纖維皺縮或崩解，閏盤及Z線不清，線粒體嚴重腫脹，線粒體嵴斷裂甚至消失，內質網(wǎng)擴大，胞核呈早期凋亡形態(tài)，大量的膠原纖維增生，可見其將肥大的心肌細胞包繞分隔成束;而SHR-I組大鼠心肌細胞肌原纖維含量較SHR-C組大鼠明顯增加，肌節(jié)較規(guī)則，線粒

36、體輕度腫脹，線粒體內空泡結構較少，心肌細胞核仁清晰，染色質分布均勻，邊集現(xiàn)象不明顯，內質網(wǎng)擴張不明顯，偶有點狀膠原纖維增生。
　　6.心肌中肌動蛋白細胞骨架的改變:WKY-C組大鼠心肌中鬼筆環(huán)肽熒光染色豐富，而SHR-C組大鼠中染色細弱，提示肌動蛋白細胞骨架含量下降;與SHR-C組大鼠相比，降低profilin-1的表達有助于肌動蛋白微絲結構和含量的保存，而profilin-1高表達則進一步減低肌動蛋白微絲的含量。
　　7.

37、心肌細胞膜上小窩豐度的檢測:WKY-C組大鼠心肌中小窩的數(shù)量是SHR-C組大鼠的3倍，統(tǒng)計學差異顯著(P＜0.001)，與SHR-C組相比，SHR-H組心肌纖維膜上小窩的數(shù)量進一步減低(P＜0.001)，而profilin-1的沉默則有助于保存SHR-I組小窩的豐度(P＜0.001)。實時定量PCR和westernblot的結果顯示SHR-H組大鼠心肌小窩蛋白-3的mRNA含量是SHR-C組大鼠的1.66±0.33倍(P＜0.05)，其

38、蛋白含量是SHR-C組大鼠的1.71±0.21倍(P＜0.001);而SHR-I組大鼠心肌小窩蛋白-3的mRNA含量是SHR-C組大鼠的42.5±2.6％(P＜0.01)，其蛋白含量是SHR-C組大鼠的33.6±3.2％(P＜0.001)，小窩蛋白-3的mRNA和蛋白表達水平與肌漿膜上小窩的數(shù)量相一致。
　　8.大鼠心肌組織中profilin-1的表達水平及細胞定位:實時定量PCR結果顯示，SHR-C組大鼠肥大心肌中profili

39、n-1的mRNA水平較WKY-C組明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，SHR-H組大鼠心肌組織中profilin-1的mRNA水平較SHR-C組上調了38.10％(P＜0.05)，而SHR-I組profilin-1的mRNA表達水平較SHR-C組降低了44.29％(P＜0.05);Westernblot結果顯示，SHR-C組大鼠肥大心肌中profilin-1的蛋白水平較WKY-C組明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，

40、與SHR-C組相比，SHR-H組大鼠心肌profilin-1蛋白水平上調了約35.29％(P＜0.05)，而SHR-I組profilin-1蛋白表達下調了38.24％(P＜0.01);免疫組化圖片顯示profilin-1蛋白表達在心肌細胞漿內，尤其在核周分布，在血管平滑肌細胞中也見到profilin-1微弱的表達，profilin-1在各組大鼠心肌細胞中的表達水平與westernblot結果一致。
　　9.大鼠血清和心肌組織中NO

41、的含量:與WKY-C組大鼠相比，SHR-C組大鼠肥大心肌中NO含量明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，SHR-H組心肌組織中NO含量明顯低于SHR-C組(P＜0.01)，而SHR-I組心肌組織中NO含量則明顯高于對照組(P＜0.05)。同時，我們檢測了血清中NO水平，結果顯示SHR-I組、SHR-C組和SHR-H組大鼠血清中NO水平無顯著差異，這提示profilin-1的高表達和沉默所引起的NO水平的變化是心肌組織內的局部變化

42、而非系統(tǒng)性反應。
　　10.大鼠心肌組織中eNOS表達水平和活性檢測:實時定量PCR和westernblot結果顯示四組大鼠心肌中eNOS的表達水平無顯著差異。進而檢測eNOS在Ser1177位點上的磷酸化水平以觀察eNOS的活性，結果顯示，與WKY-C組大鼠相比，SHR-C組大鼠心肌中eNOS的活性明顯減低;與SHR-C組大鼠相比，SHR-H組大鼠心肌中磷酸化eNOS的表達明顯降低而SHR-I組的磷酸化eNOS的表達明顯升高，差

43、異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　結論：
　　1.自發(fā)性高血壓大鼠肥大心肌組織中，profilin-1的表達上調，伴隨心肌細胞肥大、膠原纖維增生和肌動蛋白細胞骨架受損。
　　2.Profilin-1的過表達通過影響肌動蛋白細胞骨架的組裝，干擾心肌纖維膜上小窩的形成，抑制eNOS/NO信號通路的活性而促進高血壓誘導的心肌肥大，是高血壓心肌肥大的重要發(fā)病機制。
　　3.Profilin-1基因沉默主要通過增加心