自噬在衰老自發(fā)性高血壓大鼠足細(xì)胞損傷中的作用研究.pdf

1、目的：
　　觀察正常血壓衰老及高血壓衰老時(shí)大鼠腎皮質(zhì)RAS及腎小球足細(xì)胞自噬的變化，進(jìn)一步探討高血壓衰老時(shí)腎損傷的可能機(jī)制，然后用血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(Angiotensin converting enzyme inhibitors，ACEI)貝那普利和AngⅡ受體拮抗劑(AngⅡ receptor blockers，ARB)氯沙坦分別干預(yù)老年自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rat，SHR

2、)，觀察貝那普利和氯沙坦對老年SHR腎小球足細(xì)胞自噬的影響，進(jìn)一步探討ACEI/ARB腎臟保護(hù)作用的新機(jī)制。
　　方法：
　　(1)正常血壓大鼠Wistar-Kyoto-rat(WKY)分為3、13、22月齡組，均有性別、月齡、數(shù)量相匹配的SHR作為對照。監(jiān)測大鼠血壓;檢測尿蛋白、尿肌酐、血肌酐(serum creatinine，SCR)、血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、血清和腎皮質(zhì)腎素活性、An

3、gⅡ水平;觀察腎組織光鏡、透射電鏡下形態(tài)學(xué)改變，計(jì)數(shù)足細(xì)胞內(nèi)自噬體;western blot法檢測腎小球AngⅡ1型受體(AngⅡtype1 receptor,ATIR)、AngⅡ2型受體(AngⅡtype2 receptor,AT2R)、nephrin、Beclin1、LC3B-Ⅱ、Atg5、p62表達(dá)情況。
　　(2)18月齡雄性WKY為NORM組[生理鹽水2ml/d]，18月齡雄性SHR隨機(jī)分為4組:CTRL組[生理鹽水2m

4、l/d]、ACEI組[貝那普利10mg/(kg.d)]、ARB組[氯沙坦30mg/(kg.d)]、Combined組[貝那普利10mg/(kg.d)+氯沙坦30mg/(kg.d)]，每組均為6只，實(shí)驗(yàn)干預(yù)4個(gè)月。定期監(jiān)測大鼠血壓;實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)檢測尿蛋白、尿肌酐、SCR、BUN、血清及腎皮質(zhì)腎素活性、AngⅡ水平;觀察腎組織光鏡和電鏡下形態(tài)學(xué)改變，計(jì)數(shù)足細(xì)胞內(nèi)自噬體;western blot法檢測腎小球nephrin、Beclin1、LC3B

5、-Ⅱ、Atg5和p62蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　(1) WKY及SHR血壓隨著月齡增加均無明顯變化(P＞0.05)，但SHR血壓均明顯高于同月齡WKY(P＜0.05)。
　　(2)正常血壓衰老及高血壓衰老時(shí)，尿蛋白/尿肌酐比值均明顯升高（均P＜0.05）SHR尿蛋白/尿肌酐比值均明顯高于同月齡WKY(P＜0.05)。
　　(3)正常血壓衰老及高血壓衰老時(shí)，SCR、BUN水平均無明顯變化（均P＞0.05）;兩

6、組比較，僅3月齡、13月齡SHR的BUN水平分別明顯高于同月齡WKY（均P＜0.05）。
　　(4)正常血壓衰老時(shí)，血清及腎皮質(zhì)腎素活性、AngⅡ水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）;高血壓衰老時(shí)，血清及腎皮質(zhì)腎素活性、血清AngⅡ水平隨增齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），但腎皮質(zhì)AngⅡ水平隨增齡明顯降低(P＜0.05)。
　　(5)正常血壓衰老及高血壓衰老時(shí)腎臟均出現(xiàn)腎小球硬化、腎小管萎縮和間質(zhì)纖維化等衰老病變，但

7、以高血壓衰老時(shí)病變更為嚴(yán)重;正常血壓衰老時(shí)腎小球足細(xì)胞自噬體相對堆積。
　　(6)正常血壓衰老時(shí)腎小球AT1R、AT2R、Beclin1蛋白表達(dá)無明顯變化（P＞0.05），LC3B-Ⅱ、Atg5、p62蛋白表達(dá)明顯增多（均P＜0.05）;高血壓衰老時(shí)腎小球AT1R蛋白表達(dá)明顯增多，AT2R、nephrin、Beclin1、LC3B-Ⅱ、Atg5、p62蛋白表達(dá)明顯減少（均P＜0.05）。
　　(7)藥物干預(yù)后，4組SHR血壓

8、、尿蛋白/尿肌酐比值仍明顯高于NORM組，但ARB組、Combined組血壓、尿蛋白/尿肌酐比值明顯低于CTRL組(均P＜0.05)。
　　(8)藥物干預(yù)后，各組SCR、BUN差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。
　　(9)藥物干預(yù)后，CTRL組、Combined組腎皮質(zhì)腎素活性明顯低于NORM組（均P＜0.05）;Combined組血清AngⅡ水平明顯高于CTRL組（均P＜0.05）;4組SHR腎皮質(zhì)AngⅡ水平明顯低于N

9、ORM組，ARB組腎皮質(zhì)AngⅡ水平明顯高于CTRL組(均P＜0.05)。
　　(10)藥物干預(yù)后，4組SHR均可見腎小球缺血皺縮，足突融合、消失，灶性小管萎縮及間質(zhì)纖維化，但以CTRL組病變較重，Combined組病變較輕，NORM組、Combined組足細(xì)胞內(nèi)自噬體明顯多于CTRL組(均P＜0.05)。
　　(11)藥物干預(yù)后，CTRL組nephrin、Beclin1、LC3B-Ⅱ、Atg5、p62水平明顯低于NORM組

10、;ACEI組nephrin、Beclin1、LC3B-Ⅱ、Atg5水平、ARB組和Combined組nephrin、Beclin1、LC3B-Ⅱ、Atg5、p62水平均明顯高于CTRL組(均P＜0.05)。
　　討論：
　　(1)本實(shí)驗(yàn)無論是正常血壓衰老的WKY還是高血壓衰老的SHR在結(jié)構(gòu)上均出現(xiàn)腎小球硬化、腎小管萎縮和間質(zhì)纖維化等衰老病理變化，但明顯的SHR病變更加嚴(yán)重;功能上，WKY和SHR隨著月齡的增加尿蛋白/尿肌酐比

11、值明顯上升，且SHR尿蛋白/尿肌酐比值明顯高于同月齡WKY，說明衰老是腎臟結(jié)構(gòu)變化、功能衰退的因素之一，而高血壓則加重了這些衰變。
　　(2)正常血壓衰老時(shí)腎小球LC3B-Ⅱ、Atg5、p62表達(dá)明顯上升，高血壓衰老時(shí)腎小球Beclin1、LC3B-Ⅱ、Atg5、p62表達(dá)明顯下降，電鏡所見正常血壓衰老時(shí)腎小球足細(xì)胞自噬體堆積，說明WKY腎小球足細(xì)胞隨增齡細(xì)胞內(nèi)自噬體有所堆積，自噬活性是下降的，SHR腎小球足細(xì)胞自噬活性相對升高。

12、
　　(3)高血壓衰老時(shí)腎小球nephrin表達(dá)明顯少于同月齡WKY，電鏡可見老年SHR足細(xì)胞足突明顯融合脫失，可知高血壓衰老時(shí)腎小球足細(xì)胞發(fā)生損傷。高血壓衰老時(shí)腎皮質(zhì)AngⅡ水平明顯降低，腎小球AT1R蛋白表達(dá)明顯增多，AT2R蛋白表達(dá)明顯下降，足細(xì)胞自噬活性增高，推測高血壓衰老時(shí)，AngⅡ通過表達(dá)增多的AT1R持續(xù)刺激足細(xì)胞，誘導(dǎo)足細(xì)胞自噬活性保持在高水平或是過度增強(qiáng)，自噬降解包括nephrin在內(nèi)的足細(xì)胞大分子結(jié)構(gòu)蛋白過多，

13、此類蛋白清除多于合成，足細(xì)胞就會(huì)發(fā)生損傷，這可能是高血壓衰老時(shí)腎損傷的機(jī)制之一。
　　(4)ACEI/ARB干預(yù)后，與CTEL組相比，ARB組、Combined組尿蛋白/尿肌酐比值明顯降低，且ACEI組、ARB組、Combined組腎小球nephrin蛋白表達(dá)水平明顯升高，光鏡和電鏡觀察4組SHR中以Combined組腎臟病變較輕，提示ACEI/ARB對腎臟具有保護(hù)作用。
　　(5)ACEI/ARB干預(yù)后，電鏡所見ACEI組

14、、ARB組、Combined組腎小球足細(xì)胞自噬體均增多，其中Combined組的明顯多于CTRL組，結(jié)合western blot結(jié)果，提示ACEI/ARB干預(yù)后老年SHR腎小球足細(xì)胞白噬體有所堆積，自噬活性減弱。
　　(6)結(jié)合本實(shí)驗(yàn)所見，得出以下推測;老年SHR腎小球足細(xì)胞自噬活性過度增強(qiáng)，包括nephrin在內(nèi)的足細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白被過度降解而導(dǎo)致足細(xì)胞損傷，甚至是足細(xì)胞死亡，促進(jìn)了高血壓腎損傷的發(fā)生及發(fā)展;ACEI/ARB干預(yù)后，