proBDNF生物學(xué)作用的初步探討.pdf

1、目的：通過(guò)觀察腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子前體(proBDNF)在神經(jīng)元內(nèi)的合成、運(yùn)輸及其對(duì)急性高眼壓后大鼠視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞的影響，初步探討proBDNF的生物學(xué)作用及其可能機(jī)制，為神經(jīng)元損傷修復(fù)提供新的思路。 方法：制備SD大鼠坐骨神經(jīng)結(jié)扎、背根壓榨或脊髓損傷模型，動(dòng)物存活不同時(shí)間后取坐骨神經(jīng)、背根節(jié)和脊髓進(jìn)行proBDNF免疫組化染色或Western blot檢測(cè)，并進(jìn)行proBDNF免疫電鏡檢測(cè)。培養(yǎng)PC12細(xì)胞并轉(zhuǎn)染proBDNF質(zhì)粒

2、，存活3天后取細(xì)胞行proBDNF免疫染色。同時(shí)將生物素或Alexa-488標(biāo)記的proBDNF或小牛白蛋白(BSA)注射入正常SD大鼠坐骨神經(jīng)，6小時(shí)或16小時(shí)后取坐骨神經(jīng)和腰4、5背根節(jié)進(jìn)行顯色觀察。 正常成年SD大鼠分為單純高眼壓模型(HIOP)組、正常羊血清預(yù)處理+高眼壓模型(NGS+HIOP)組、抗proBDNF血清預(yù)處理+HIOP組和單純抗proBDNF血清預(yù)處理組。單純抗proBDNF血清預(yù)處理組、NGS+HIOP

3、組和抗proBDNF血清預(yù)處理+HIOP組大鼠左眼玻璃體內(nèi)注射正常羊血清或抗proBDNF血清。2天后，HIOP組、NGS+HIOP組和抗proBDNF血清預(yù)處理+HIOP組動(dòng)物左眼眼壓升高至閃光視網(wǎng)膜電圖b波消失的臨界眼壓(102.4 mmHg±9.2mmHg)且維持缺血60分鐘，右眼設(shè)為正常對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分別存活1，3，7天后取視網(wǎng)膜行Nissl、Hoechst和TUNEL染色。 體外培養(yǎng)胚鼠海馬神經(jīng)元，并分別給予proB

4、DNF、preBDNF和抗proBDNF血清處理，30分鐘、1或48小時(shí)后取細(xì)胞行Nissl染色、ELK-P、ERK2和c-fos免疫細(xì)胞化學(xué)染色。 結(jié)果：結(jié)果顯示proBDNF免疫陽(yáng)性產(chǎn)物沉積于坐骨神經(jīng)、背根及脊髓損傷處的近側(cè)端和遠(yuǎn)側(cè)端，24小時(shí)達(dá)高峰，近側(cè)端可持續(xù)達(dá)7天而遠(yuǎn)側(cè)端可達(dá)3天。在坐骨神經(jīng)的近側(cè)端和遠(yuǎn)側(cè)端、背根節(jié)和脊髓可檢測(cè)到全分子量大小的完整proBDNF。在正常脊髓內(nèi)，proBDNF免疫陽(yáng)性產(chǎn)物主要沉積于后角Ⅰ、

5、Ⅱ板層內(nèi)的纖維末梢中的突觸囊泡、突觸成分及線粒體，坐骨神經(jīng)結(jié)扎后其近側(cè)端也可見(jiàn)proBDNF免疫陽(yáng)性產(chǎn)物主要沉積于大的致密核心囊泡和線粒體上。轉(zhuǎn)染proBDNF質(zhì)粒后，PC12細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)proBDNF免疫陽(yáng)性產(chǎn)物分布于胞體和突起。注射經(jīng)生物素或Alexa-488標(biāo)記的proBDNF后，坐骨神經(jīng)全長(zhǎng)及背根節(jié)神經(jīng)元均可見(jiàn)陽(yáng)性產(chǎn)物。 在正常視網(wǎng)膜，Nissl染色顯示視網(wǎng)膜層次清晰，細(xì)胞排列規(guī)則；NGS+HIOP組和HIOP組視網(wǎng)膜形態(tài)

6、結(jié)構(gòu)改變類(lèi)似，HIOP后內(nèi)層視網(wǎng)膜厚度變薄，節(jié)細(xì)胞層細(xì)胞數(shù)目進(jìn)行性下降；與NGS+HIOP組相比，抗proBDNF血清預(yù)處理+HIOP組節(jié)細(xì)胞層可見(jiàn)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞且存活細(xì)胞數(shù)明顯減少、視網(wǎng)膜層次結(jié)構(gòu)紊亂并在內(nèi)層視網(wǎng)膜有大量的細(xì)胞彌散排列。單純抗proBDNF血清預(yù)處理組視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)與正常對(duì)照組類(lèi)似。 在培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元中，給予proBDNF處理后，可見(jiàn)培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)ELK-p、ERK2和c-fos表達(dá)明顯上調(diào)，部分細(xì)胞核深染；而用

7、抗血清中和內(nèi)源性proBDNF后，ELK-P、ERK2和c—fos均下調(diào)，且細(xì)胞出現(xiàn)腫脹、空泡樣變化。preBDNF處理組培養(yǎng)細(xì)胞c-fos表達(dá)上調(diào)，ELK-P、ERK2的表達(dá)水平則與空白對(duì)照組類(lèi)似。 結(jié)論：proBDNF作為一完整的蛋白分子，其本身可以被初級(jí)感覺(jué)神經(jīng)元順行和逆行輸送。與成熟BDNF類(lèi)似，內(nèi)源性proBDNF能進(jìn)入調(diào)節(jié)性分泌通路中的分泌囊泡內(nèi)；在視網(wǎng)膜內(nèi)則可能與成熟的BDNF發(fā)揮協(xié)同作用，共同維持神經(jīng)元的存活。p