纖維連接蛋白表面修飾對促進(jìn)新型聚酯材料人工韌帶生物相容性的研究.pdf

1、目的： 采用體外細(xì)胞培養(yǎng)的方法研究新型聚酯材料人工韌帶（LARS）在生物相容性，并探討采用纖維連接蛋白（Fn）表面修飾方法增進(jìn)其生物相容性的有效性。 材料和方法： 首先對LARS 人工韌帶材料進(jìn)行處理，在無菌操作下將其剪為7 mm×7mm 大小正方形形狀，密封包裝，紫外消毒。 將消毒處理后的部分LARS 人工韌帶材料經(jīng)堿性水解后和Fn 溶液反應(yīng)，制成表面蛋白修飾的韌帶材料供使用，處理后材料同時(shí)采用傅里葉

2、變紅外光譜分析和X 線衍射分析其化學(xué)組成。 利用改良組織塊培養(yǎng)法對SD 大鼠顱骨進(jìn)行成骨細(xì)胞的原代培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞長至半?yún)R合后進(jìn)行傳代，傳代時(shí)用差速黏附法提純成骨細(xì)胞。然后對第2～3 代成骨細(xì)胞進(jìn)行觀察和鑒定，包括倒置相差顯微鏡觀察其形態(tài)及生長情況、臺盼藍(lán)染色測定細(xì)胞活力、細(xì)胞堿性磷酸酶染色、鈣結(jié)節(jié)茜素紅染色等染色鑒定為成骨細(xì)胞。 將2～3 代成骨細(xì)胞分別與LARS 人工韌帶支架材料（L 組）和經(jīng)纖維連接蛋白表面預(yù)處理的

3、支架材料（S 組）在體外實(shí)驗(yàn)下共同培養(yǎng)，在相差顯微鏡下和掃描電子顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長情況，并在一定的時(shí)間段分別測定成骨細(xì)胞在其黏附、生長增殖、功能能力，包括：1 細(xì)胞黏附能力測定：細(xì)胞與材料共培養(yǎng)后2h、3h、4h 后，將標(biāo)本在用掃描電鏡觀察，并計(jì)數(shù)，比較兩組材料上黏附成骨細(xì)胞數(shù)量的區(qū)別。2 細(xì)胞增殖能力測定: 細(xì)胞與材料共培養(yǎng)后0～12d,隔天采用酶消化法消化材料，分別采用細(xì)胞記數(shù)板記數(shù)法和MTT 比色法，畫出兩種材料表面細(xì)胞的生長

4、曲線。3 細(xì)胞功能測定：測定細(xì)胞與材料共培養(yǎng)后0～12d 隔天的細(xì)胞堿性磷酸酶的吸光度，根據(jù)A 值畫出兩種材料表面細(xì)胞的功能曲線。4 細(xì)胞生長情況觀察：分別在培養(yǎng)后第3，第9 天取兩組標(biāo)本拍攝掃描電鏡照片觀察細(xì)胞生長增殖情況.在培養(yǎng)12 天后，分別取兩組標(biāo)本周緣進(jìn)行ALP 染色，觀察細(xì)胞與材料的生物相容性。 結(jié)果: 紅外透射光譜提示S 組材料上Fn 蛋白和材料形成了牢固的化學(xué)鍵結(jié)合，X線衍射分析結(jié)果在S 組材料上氮元素

5、含量達(dá)到了12.44％。 在細(xì)胞和材料共培養(yǎng)后，在相差顯微鏡下可見第２天起在材料的周邊可見梭形和三角形的細(xì)胞游離出，進(jìn)而貼壁會合，數(shù)量逐漸增多。掃描電鏡結(jié)果顯示，細(xì)胞在接種到材料上后2h 后即有黏附效應(yīng)，隨時(shí)間推移，數(shù)量逐漸增多，S 組材料上細(xì)胞要多于L 組（p＜0.05)。細(xì)胞計(jì)數(shù)和MTT 比色結(jié)果顯示，細(xì)胞后在接種到材料后開始增殖,S 組材料和L 材料上細(xì)胞增殖基本符合正常細(xì)胞增殖曲線，S 組材料細(xì)胞對數(shù)增殖期較L 組材料

6、細(xì)胞增殖期長，且最高峰值也高（p＜0.05)。 ALP 測定發(fā)現(xiàn)細(xì)胞ALP 值隨時(shí)間推移基本穩(wěn)定，略有下降，兩組之間沒有明顯差異。（p=0.46). 掃描電鏡結(jié)果顯示，LARS人工材料具有良好的空隙結(jié)構(gòu),適合細(xì)胞的黏附和生長,L組材料和S組材料上細(xì)胞生長增殖情況良好,但S組材料上細(xì)胞在培養(yǎng)3天后即表現(xiàn)出典型的成纖維細(xì)胞狀形態(tài),9天時(shí)S組材料上細(xì)胞增殖匯合以及分泌胞外基質(zhì)情況明顯好于L組.ALP染色結(jié)果顯示在S組材料纖

7、維表面可以觀察到較L組材料明顯的染色濃聚沉積,證明細(xì)胞有更好的黏附生長。 討論: LARS人工韌帶是一種新型的聚酯材料(聚對苯二甲酸乙二酯,PET) 人工韌帶,具有良好的力學(xué)性能, 但據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[1 2]PET材料的分子結(jié)構(gòu)對稱,結(jié)晶度較高,親水性較差,其生物相容性如何仍受到質(zhì)疑。 我們采用將韌帶支架材料表面水解的方法后和高濃度的Fn蛋白溶液反應(yīng),形成PET-Fn材料,以期提高其生物相容性。材料學(xué)檢測結(jié)果證實(shí)了

8、蛋白和材料表面修飾的有效性。細(xì)胞和材料的共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)表明,細(xì)胞在LARS人工韌帶表面能夠黏附增殖分化,具有一定的功能.采用蛋白表面修飾的LARS韌帶材料,效果更佳。掃描電鏡照片和ALP染色結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn),推測這與采用蛋白表面修飾改變材料的相關(guān)理化特性，有利于細(xì)胞黏附,同時(shí)Fn蛋白作為細(xì)胞黏附蛋白,有效的增進(jìn)了細(xì)胞與材料的黏附效應(yīng),進(jìn)而促進(jìn)了細(xì)胞的增殖。 結(jié)論: LARS人工韌帶作為一種新型的聚酯材料人工韌帶,在體外細(xì)胞