介孔碳納米粒的表面修飾及其生物相容性研究.pdf

1、在生物醫(yī)藥領(lǐng)域眾多具有應(yīng)用前景的納米材料中，碳基納米材料占據(jù)著重要的地位，如碳納米管、石墨烯和介孔碳材料等，其中介孔碳納米材料是一類新型具有較大應(yīng)用潛能的多孔碳納米材料。它具有大的比表面積和孔容，能提供高的載藥能力;具有可調(diào)的孔徑結(jié)構(gòu)和孔隙，可以控制內(nèi)裝藥物分子的釋放，在藥物傳送系統(tǒng)領(lǐng)域有較好的應(yīng)用前景，然而在用于臨床之前，必須充分了解納米材料的物理化學(xué)性質(zhì)和不良的生理反應(yīng)，仔細(xì)的評(píng)估毒性和生物相容性。前期研究中本課題組成功制備了PEG

2、修飾的氧化介孔碳納米粒作為抗腫瘤藥物阿霉素(DOX)的載體，該納米粒具有良好的親水性和很高的載藥量，DOX的釋放具有pH響應(yīng)性，同時(shí)在體內(nèi)外具有良好的抗腫瘤活性。其他已有的研究也表明，在碳納米材料表面修飾或嫁接某些親水性分子如聚乙二醇(PEG)或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，可改善碳納米材料的分散性和血液穩(wěn)定性，顯著提高載體吸附藥物的能力和在循環(huán)系統(tǒng)半衰期，避免網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的捕獲以防止藥物在傳遞過(guò)程中的非特異性釋放，從而提高碳納米材料的生物

3、相容性。
　　因此本課題擬在前期工作基礎(chǔ)上，用聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-甲氧基聚乙二醇2000(DSPE-mPEG2000)對(duì)介孔碳納米粒進(jìn)行表面修飾，從細(xì)胞水平、免疫系統(tǒng)作用和整體動(dòng)物水平研究修飾前后介孔碳納米粒的生物相容性，為介孔碳材料未來(lái)在臨床醫(yī)藥領(lǐng)域的可能應(yīng)用提供一定的依據(jù)。
　　第一章主要介紹了介孔碳納米粒的合成、表面修飾及相關(guān)表征。我們通過(guò)低濃度水熱合成法成功制備了介孔碳納米粒，透射電鏡等檢

4、測(cè)表明介孔碳納米粒為較規(guī)則的球形，粒徑均一，約為90nm，同時(shí)具有良好的有序介觀結(jié)構(gòu)。主要依靠介孔碳納米粒強(qiáng)吸附作用在其表面進(jìn)行修飾，并通過(guò)透射電鏡、傅立葉紅外光譜、熱重分析、核磁、紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)和馬爾文粒徑儀等對(duì)修飾前后的介孔碳納米粒進(jìn)行了較系統(tǒng)的表征，表明PVP和DSPE-mPEG2000成功的修飾到介孔碳納米粒的表面，并提高了其在水溶液中的分散性和穩(wěn)定性。細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，介孔碳納米粒可以在較短時(shí)間內(nèi)(2h)被正常細(xì)胞或

5、腫瘤細(xì)胞攝取。
　　第二章主要是測(cè)定了修飾前后介孔碳納米粒的細(xì)胞毒性和對(duì)細(xì)胞的氧化應(yīng)激水平的影響。通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)、活性氧檢測(cè)等方法測(cè)定表明，在低于100μg/ml濃度范圍內(nèi)，MCN、MCN-PVP和MCN-PEG與L929細(xì)胞共孵育24h時(shí)，MCN表現(xiàn)出輕微的細(xì)胞毒性，而PVP和DSPE-mPEG2000對(duì)MCN的表面修飾能降低其對(duì)L929細(xì)胞的毒性;而48h時(shí)，不同濃度的MCN細(xì)胞存活率有所提高，說(shuō)明MCN本身

6、對(duì)L929細(xì)胞的毒性較低。修飾和未修飾的介孔碳納米粒與HeLa細(xì)胞共孵育24h或48h后，均未觀察到細(xì)胞毒性作用，說(shuō)明介孔碳納米粒是相對(duì)安全的。細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，修飾和未修飾的介孔碳納米粒不會(huì)誘導(dǎo)L929和HeLa細(xì)胞發(fā)生凋亡。細(xì)胞內(nèi)ROS水平測(cè)定表明，MCN可顯著誘導(dǎo)L929和HeLa細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，產(chǎn)生ROS量隨著納米粒濃度的增加而增多，但修飾后的介孔碳納米粒相比未修飾前可顯著降低刺激細(xì)胞產(chǎn)生ROS的量，降低細(xì)胞氧化應(yīng)激水

7、平和介孔碳納米粒對(duì)細(xì)胞的刺激性。
　　第三章我們完成了介孔碳納米粒的初步免疫毒性評(píng)價(jià)。100μg/ml的MCN、MCN-PVP和MCN-PEG刺激能夠mDCs表面分子CD11c、I-Ab、CD40表達(dá)量升高，促進(jìn)mDCs表型成熟。濃度為100μg/ml時(shí)，PVP和DSPE-mPEG2000修飾后介孔碳納米粒能顯著的降低未修飾介孔碳納米粒刺激小鼠樹(shù)突狀細(xì)胞分泌的炎癥細(xì)胞因子TNF-α和IL-6的水平。在25～100μg/ml濃度范圍

8、內(nèi)，MCN、MCN-PVP和MCN-PEG能誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞的凋亡，并且隨著納米粒濃度的增大T淋巴細(xì)胞凋亡的越多。高濃度時(shí)，對(duì)T淋巴細(xì)胞有較高的免疫毒性，PVP和DSPE-mPEG2000修飾后沒(méi)有明顯的降低T淋巴細(xì)胞的凋亡率。通過(guò)生物透射電子顯微鏡的觀察到介孔碳納米粒通過(guò)細(xì)胞的內(nèi)吞進(jìn)入到RAW264.7細(xì)胞，并在細(xì)胞質(zhì)中聚集，作為藥物載體可以攜帶藥物穿過(guò)細(xì)胞膜。修飾和未修飾的介孔碳納米粒對(duì)RAW264.7細(xì)胞毒性小，可能由于小鼠巨噬細(xì)胞

9、較強(qiáng)的吞噬和降解處理能力有關(guān)。
　　第四章介孔碳納米粒的生物毒性效應(yīng)初步研究。MCN、MCN-PVP和MCN-PEG濃度在0～100μg/ml范圍內(nèi)均無(wú)溶血現(xiàn)象（HR％＜5％），說(shuō)明介孔碳納米粒具有良好的血液相容性。連續(xù)7天尾靜脈注射劑量為0.2ml/10g、濃度為1mg/ml的MCN、MCN-PVP和MCN-PEG后，各器官的組織切片說(shuō)明納米粒不會(huì)引起小鼠的組織纖維化、變性和壞死等病理性改變。但是在肺組織切片中可以觀察到聚齊的介

10、孔碳納米粒，可能是由于其在體內(nèi)的血流動(dòng)力學(xué)影響，PVP或DSPE-mPEG2000修飾后的介孔碳納米?？梢詼p少在肺的殘留量，因?yàn)榻榭滋技{米粒容易在血管壁沉積，而修飾后的納米粒分散性提高，提高M(jìn)CN-PVP和MCN-PEG在血管中的流動(dòng)性。介孔碳納米粒不影響小鼠的肝腎功能，也沒(méi)有激活小鼠的補(bǔ)體C3。
　　以上結(jié)果表明，本課題成功制備了介孔碳納米粒，并成功的將生物相容性的高分子PVP和PEG修飾到介孔碳納米粒的表面。從細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)可以