司帕沙星和恩諾沙星抗血清制備及其ELIAS分析應(yīng)用.pdf

1、司帕沙星(SPFX)和恩諾沙星(ENR)均為氟喹諾酮類抗菌藥，在我國作為臨床用藥和獸藥而被廣泛應(yīng)用。隨著近年來，SPFX和ENR應(yīng)用時(shí)所產(chǎn)生的不良反應(yīng)和耐藥性的報(bào)道越來越多，為了藥物使用的安全性，防止因用藥不當(dāng)而造成的不良后果，對(duì)體內(nèi)藥物進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測是非常必要的。目前，體內(nèi)藥物分析的常用方法仍然是使用各種現(xiàn)代儀器進(jìn)行分析。然而，在分析樣品過程中，這些方法往往需要繁瑣的樣品前處理，造成實(shí)際樣品的損失，而且，某些方法的靈敏度還不能達(dá)到藥物在

2、體內(nèi)分析過程中的測定要求。因此研究出一種簡便快速且靈敏的測定體內(nèi)司帕沙星和恩諾沙星的方法，對(duì)臨床用藥具有非常好的指導(dǎo)意義，同時(shí)也為動(dòng)物源性食品中的藥物殘留檢測提供快速有效的方法。主要研究內(nèi)容如下：
　　 ⑴采用混合酸酐法將SPFX分別與載體蛋白(BSA和OVA)偶聯(lián)，制備免疫抗原SPFX-BSA和包被抗原SPFX-OVA。分別經(jīng)紫外光譜、紅外光譜證明偶聯(lián)的兩種人工抗原偶聯(lián)成功，并通過紫外光譜法計(jì)算出SPFX在各個(gè)蛋白質(zhì)上的偶聯(lián)數(shù)

3、。通過皮下多點(diǎn)注射法免疫兩只日本大耳白兔。首次免疫采用2 mg的SPFX-BSA溶于2 mL生理鹽水中，并與等體積的弗氏完全佐劑乳化后進(jìn)行免疫，每隔10天加強(qiáng)免疫一次，最后一次免疫注射5天后，頸動(dòng)脈取全血后的抗血清。通過ELISA檢測得到的抗血清，效價(jià)達(dá)到1:102400。理想包被抗原的濃度為1μg/mL，抗血清的工作濃度為1:25600。優(yōu)化條件后，得回歸曲線y=-0.1636x+0.8881(R2=0.9942)，檢測范圍為5 ng

4、/ml～2μg/mL?？寡迮c其他選擇的喹諾酮類藥物和非同類藥物基本無交叉反應(yīng)，說明本實(shí)驗(yàn)所制備的抗血清特異性強(qiáng)。為了考察ELISA方法的準(zhǔn)確性，在牛奶、豬肉、小鼠血漿和小鼠尿液中的加樣回收率分別為93.7％-110.3％、98.3％-104.9％、105.6％-113.3％和90.2％-98.1％。相對(duì)應(yīng)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為6.6％-10.6％、7.4％-19.5％、4.8％-8.2％和3.5％-9.6％。選擇九個(gè)不同的濃度，進(jìn)行ELIS

5、A方法和HPLC方法相關(guān)性的比較，得到回歸方程為：y=1.0235x+0.1347(R2=0.9918)，同時(shí)用兩種方法檢測司帕沙星片劑和膠囊中司帕沙星的含量，結(jié)果相似。說明兩種檢測方法具有較好的相關(guān)性。為了進(jìn)一步擴(kuò)大ELISA方法的使用范圍，以大鼠為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，探討了司帕沙星的體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)過程，測得了司帕沙星藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)：AUC0-∞、Tmax、Cmax分別為2.169 mg h L-1、3 h和346.06ng mL-1。此外還初

6、步進(jìn)行了司帕沙星在小鼠組織中的分布情況的研究。
　　 ⑵采用混合酸酐法將ENR分別與載體蛋白(BSA和OVA)偶聯(lián)，制備免疫抗原ENR-BSA和包被抗原ENR-OVA。分別經(jīng)紫外光譜、紅外光譜和熒光光譜證明偶聯(lián)的四種人工抗原偶聯(lián)成功，并通過紫外光譜法計(jì)算出ENR在各個(gè)蛋白質(zhì)上的偶聯(lián)數(shù)。通過相同的免疫劑量和免疫方法，制備抗血清。ELISA方法檢測得到的抗血清，效價(jià)達(dá)到1:102400，理想包被抗原的濃度為500 ng/mL，抗血清

7、的工作濃度為1:25600。優(yōu)化條件后，得回歸曲線y=-0.2288x-1.0147(R2=0.9852)，檢測范圍為5 ng/ml～2μg/mL?？寡迮c其他選擇的同類喹諾酮類藥物和非同類藥物基本無交叉反應(yīng)，說明本實(shí)驗(yàn)所制備的抗血清特異性強(qiáng)。在牛奶、豬肉、小鼠血漿和小鼠尿液中的加樣回收率分別為98.4％-105.8％、94.2％-102.4％、91.7％-101.2％和97.0％-110.3％。相對(duì)應(yīng)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.6％-10.6

8、％、5.7％-17.9％、4.8％-7.2％和4.5％-9.6％。選擇九個(gè)不同的濃度，進(jìn)行ELISA方法和HPLC方法相關(guān)性的比較，得到回歸方程為：y=0.9866x+0.5906(R2=0.9892)，同時(shí)用兩種方法檢測恩諾沙星注射液中恩諾沙星的含量，結(jié)果相似。說明兩種檢測方法具有較好的相關(guān)性。為了進(jìn)一步擴(kuò)大ELISA方法的使用范圍，以大鼠為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，探討了恩諾沙星的體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)過程，測得了恩諾沙星藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)：Tmax為0.75