超聲微泡促進(jìn)Matrilin-2 shRNA轉(zhuǎn)染對(duì)肝卵圓細(xì)胞增殖影響的研究.pdf

1、目的：
　　 1.建立一種新的體外留置性大鼠門(mén)靜脈置管模型,探討超聲微泡經(jīng)門(mén)靜脈用藥途徑下促進(jìn)目的基因在肝臟表達(dá)的作用,為體內(nèi)肝臟靶向性基因的傳送提供一種理想的方法。
　　 2.通過(guò)應(yīng)用超聲微泡介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù),探討matrilin-2對(duì)卵圓細(xì)胞增殖、分化的調(diào)控作用,為細(xì)胞外基質(zhì)成分matrilin-2參與調(diào)控卵圓細(xì)胞增殖介導(dǎo)的肝再生提供科學(xué)依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.大鼠體外留置性門(mén)靜脈置管模型

2、的建立:通過(guò)腸系膜上靜脈屬支,在導(dǎo)絲引導(dǎo)下將介入微導(dǎo)管插入門(mén)靜脈內(nèi),固定并潛行于皮下經(jīng)頸背部引出體外,供藥物注射用。
　　 2.EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組:將60只健康SPF級(jí)雄性SD大鼠隨機(jī)分為A、B、C三組,每組20只大鼠。A組經(jīng)尾靜脈注射單純EGFP裸質(zhì)粒;B、C組分別經(jīng)尾靜脈和門(mén)靜脈導(dǎo)管注射微泡與EGFP質(zhì)粒混懸液,同時(shí)按設(shè)定參數(shù)和時(shí)間超聲輻照肝區(qū)。
　　 3.分別于轉(zhuǎn)染后24h、3d、7d、11d處死A、B、

3、C三組大鼠獲取肝臟組織,每個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死4只大鼠。標(biāo)本立即快速冰凍,488nm激發(fā)光熒光顯微鏡觀(guān)察快速冰凍切片中:EGFP表達(dá),507nm的熒光照像,曝光時(shí)間均選擇800ms,Image proplus軟件分析視野中EGFP表達(dá)量與轉(zhuǎn)染效率,同時(shí)病理切片觀(guān)察肝組織結(jié)構(gòu)。
　　 4.大鼠肝卵圓細(xì)胞增殖模型建立及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組:將90只健康SPF級(jí)雄性SD大鼠隨機(jī)分為D、E、F三個(gè)組,每組30只大鼠。D組建立單純大鼠肝卵圓細(xì)胞增殖模型;

4、E、F組建立卵圓細(xì)胞增殖模型同時(shí)分別經(jīng)尾靜脈、門(mén)靜脈在超聲微泡介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染matrilin-2 shRNA質(zhì)粒。
　　 5.于肝切除術(shù)后第4、8、12、16、20天處死D、E、F三組大鼠獲取肝臟組織,每個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死5只大鼠。切取一部分立即快速冰凍切片,并于熒光顯微鏡下觀(guān)察EGFP表達(dá);另一部分用10％中性甲醛固定,用于制作病理切片,觀(guān)察各組各時(shí)間點(diǎn)HOC形態(tài)及增殖情況,SP免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)卵圓細(xì)胞標(biāo)志OV-6表達(dá);最后切取一部

5、分組織保存于液氮,備實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)各組各時(shí)間點(diǎn)肝臟組織中matrilin-2 mRNA的表達(dá)。
　　 6.運(yùn)用SPSS18.0軟件包對(duì)matrilin-2 mRNA表達(dá)量與HOC計(jì)數(shù)進(jìn)行spearman線(xiàn)性相關(guān)分析。
　　 結(jié)果：
　　 1.建立體外留置性門(mén)靜脈置管模型的20只大鼠中,2只大鼠因術(shù)中操作致出血死亡,術(shù)后15h出現(xiàn)1只大鼠死亡,解剖發(fā)現(xiàn)死亡原因?yàn)閷?dǎo)管從血管中脫出導(dǎo)致出血,其余17只大鼠全部存

6、活,總存活率為85%。
　　 2.EGFP在肝臟的表達(dá)情況:A、B、C三組大鼠轉(zhuǎn)染后24h發(fā)現(xiàn)少量熒光于肝臟表達(dá),第3天達(dá)到高峰,A組3天后逐漸減少,至第7天熒光基本消失;B、C兩組轉(zhuǎn)染后且第7天仍持續(xù)表達(dá),此后減少,第11天僅見(jiàn)微量熒光表達(dá):轉(zhuǎn)染后第3天及第7天B、C兩組轉(zhuǎn)染效果較A組均明顯增強(qiáng)(p＜0.01),轉(zhuǎn)染后第3天C組較B組轉(zhuǎn)染效果略有增強(qiáng)(p＜0.05)。
　　 3.肝卵圓細(xì)胞增殖模型大鼠一般情況:D組,即

7、單純卵圓細(xì)胞增殖模型組大鼠術(shù)后活動(dòng)減少、精神差,隨后出現(xiàn)毛松無(wú)光澤、尿黃、腹水,3只大鼠死亡,死亡率10%,鼠尾靜脈(E)和門(mén)靜脈(F)質(zhì)粒注射干擾組被毛松亂更明顯、尿黃,腹水增多,死亡率分別為13.3%和20%。
　　 4.肝卵圓細(xì)胞增殖模型大鼠形態(tài)學(xué)與組織學(xué)變化:D組大鼠肝臟代償性增大、充血、肝緣圓鈍,表面及切面可見(jiàn)散在圓形點(diǎn)狀病灶、不凸出肝表面,部分見(jiàn)出血點(diǎn)。鏡下肝細(xì)胞水腫、肝索結(jié)構(gòu)紊亂,匯管區(qū)增生反應(yīng),可見(jiàn)圓形或卵圓形、

8、胞漿少、核質(zhì)比高的HOC,術(shù)后20天結(jié)構(gòu)完全恢復(fù),恢復(fù)后肝索排列整齊。E、F兩組和D組相比,肝臟出血點(diǎn)明顯,點(diǎn)狀病灶增多,鏡下肝細(xì)胞水腫嚴(yán)重,肝索結(jié)構(gòu)紊亂,匯管區(qū)增生反應(yīng)較模型組少,術(shù)后20天恢復(fù)后肝索結(jié)構(gòu)較D組紊亂。
　　 5.免疫組織化學(xué)檢測(cè)OV-6表達(dá):D組術(shù)后4天于匯管區(qū)可見(jiàn)OV-6表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞,第8天陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增多,第12天陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)達(dá)到高峰,開(kāi)始離開(kāi)匯管區(qū)想小葉中央遷移,部分OV-6陽(yáng)性細(xì)胞己開(kāi)始分化,第16天

9、OV-6陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯減少,第20天僅見(jiàn)極少數(shù)OV-6陽(yáng)性細(xì)胞。E、F兩干擾組與D組相比,第8天及第12天OV-6陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)減少(p＜0.05),兩干擾組之間無(wú)明顯差異。
　　 6.實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)matrilin-2表達(dá):D組第12天matrilin-2 mRNA表達(dá)達(dá)到高峰,此后減少,第20天基本恢復(fù)正常生理水平。E、F兩干擾組第8天、第12天表達(dá)較D組少(p＜0.05),第20天較正常生理水平略高。
　　 7.將

10、HOC計(jì)數(shù)與matrilin-2 mRNA表達(dá)量行線(xiàn)性相關(guān)分析:D組相關(guān)系數(shù)r=0.79,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);E、F組相關(guān)系數(shù)分別為r=0.76、r=0.74(p＜0.05),相關(guān)性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.成功對(duì)大鼠體外留置性門(mén)靜脈置管模型改良,具有操作方法簡(jiǎn)單、術(shù)后死亡率低、成功率高等優(yōu)點(diǎn)。
　　 2.超聲聯(lián)合微泡造影劑促進(jìn)目的基因的體內(nèi)轉(zhuǎn)染率,尤其聯(lián)合門(mén)靜脈置管模型增

11、強(qiáng)效果更明顯,有望成為一種有效、安全的肝臟靶向性基因轉(zhuǎn)運(yùn)方法。
　　 3.成功建立大鼠HOC增殖模型,且matrilin-2 mRNA表達(dá)與}tOC增殖數(shù)目呈正相關(guān)關(guān)系。
　　 4.超聲微泡介導(dǎo)轉(zhuǎn)染matrilin-2 shRNA質(zhì)粒有效下調(diào)了大鼠matrilin-2表達(dá),matrilin-2下調(diào)后HOC增殖數(shù)目減少,肝索結(jié)構(gòu)恢復(fù)差,表明matrilin-2可能參與調(diào)控HOC增殖介導(dǎo)的肝再生。
　　 5.闡明肝內(nèi)