腹腔鏡CO-,2-氣腹對人宮頸癌CaSki細(xì)胞體外生長的影響及其機(jī)制的研究.pdf

1、腹腔鏡手術(shù)以其損傷和痛苦小、并發(fā)癥少、住院時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)越來越多地應(yīng)用于惡性腫瘤的治療。但是，近年來文獻(xiàn)卻不斷出現(xiàn)腹腔鏡術(shù)后發(fā)生腫瘤穿刺孔轉(zhuǎn)移(port-site tumor metastasis，PSM)及腹腔內(nèi)腫瘤播散的病例報(bào)道。國內(nèi)外學(xué)者們進(jìn)行了多項(xiàng)相關(guān)實(shí)驗(yàn)，提示腹腔鏡術(shù)后發(fā)生腫瘤穿刺孔轉(zhuǎn)移及腹腔內(nèi)播散是多因素參與的結(jié)果，比如穿刺孔部位的組織損傷，CO<,2>沿戳卡的泄漏，腫瘤細(xì)胞的氣霧化，氣腹介質(zhì)的選擇和免疫功能的改變等，而腹腔鏡

2、手術(shù)中所通常使用的CO<,2>氣腹可能是促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長和播散的最重要的因素。在婦科惡性腫瘤領(lǐng)域，已有研究發(fā)現(xiàn)CO<,2>氣腹能促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞、子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的體外生長和轉(zhuǎn)移，且與CO<,2>氣腹促使某些基因的表達(dá)發(fā)生改變有關(guān)。宮頸癌是婦科最常見的惡性腫瘤，婦科惡性腫瘤領(lǐng)域里腹腔鏡也更多地應(yīng)用于宮頸癌的根治術(shù)，但迄今為止，國內(nèi)外尚未見腹腔鏡CO<,2>氣腹對宮頸癌細(xì)胞生長的影響及其機(jī)制的相關(guān)報(bào)道。 本研究擬通過建立CO<,2>氣

3、腹體外模型，觀察CO<,2>氣腹對人宮頸癌CaSki細(xì)胞體外生長的影響并探討其相關(guān)機(jī)制，為評估腹腔鏡CO<,2>氣腹應(yīng)用于宮頸癌治療的安全性提出實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。 第一部分腹腔鏡CO<,2>氣腹體外模型的建立 [目的] 建立一個(gè)理想的CO<,2>氣腹體外模型并評價(jià)其效果。 [方法] 采用不銹鋼密封罐和自動(dòng)氣腹機(jī)建立CO<,2>氣腹體外模型，用MTT法觀察CO<,2>氣腹(7mmHg，4h)對人宮頸癌CaSki細(xì)胞體外生

4、長的影響。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。設(shè)未處理組為對照。 [結(jié)果] CO<,2>氣腹組和對照組同次處理的組間比較結(jié)果顯示，處理后第1～2d兩組吸光度值無明顯差異(P>0.05)，處理后第3～5d CO<,2>氣腹組各時(shí)間點(diǎn)吸光度值明顯高于對照組(P<0.05)。兩組組內(nèi)三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)同一時(shí)間點(diǎn)所測吸光度值(A)無顯著差異(P>0.05)。 [結(jié)論] 采用密封罐和自動(dòng)氣腹機(jī)所建立的CO<,2>氣腹體外模型是進(jìn)行腹腔鏡體外研究的一種理想模型

5、；采用該模型發(fā)現(xiàn)CO<,2>氣腹可促進(jìn)人宮頸癌CaSki細(xì)胞的體外生長。 第二部分腹腔鏡CO<,2>氣腹對人宮頸癌CaSki細(xì)胞體外生長的影響 [目的] 探討CO<,2>氣腹對人宮頸癌CaSki細(xì)胞體外生長的影響。 [方法] 采用第一部分所建立的體外模型對CaSki細(xì)胞進(jìn)行CO<,2>氣腹處理，處理壓力為：0mmHg、7mmHg、14mmHg，處理時(shí)間為：1h，2h，3h，4h，以未處理組為對照組。通過采用MTT

6、法描繪各組細(xì)胞生長曲線，流式細(xì)胞儀測定各組細(xì)胞周期分布情況并計(jì)算細(xì)胞增殖指數(shù)(PI)，透視電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變等指標(biāo)觀察不同壓力的CO<,2>氣腹持續(xù)不同時(shí)間對人宮頸癌CaSki細(xì)胞體外生長的影響。 [結(jié)果] 1．析因設(shè)計(jì)的方差分析結(jié)果顯示，CO<,2>氣腹處理壓力和時(shí)間均為CaSki細(xì)胞生長的影響因素，且兩者有交互作用。 2．各處理組生長曲線的比較。 3．各處理組細(xì)胞周期分布的比較。 [結(jié)論

7、] 在一定的壓力和作用時(shí)間范圍，CO<,2>氣腹促進(jìn)人宮頸癌CaSki細(xì)胞的體外生長。 第三部分腹腔鏡CO2氣腹促CaSki細(xì)胞體外生長的機(jī)制探討 [目的] 探討腹腔鏡CO<,2>氣腹促進(jìn)人宮頸癌CaSki細(xì)胞體外生長的機(jī)制。 [方法] 采用第一部分所建立的體外模型對CaSki細(xì)胞進(jìn)行CO<,2>氣腹處理，處理壓力為：0mmHg、7mmHg、14mmHg，處理時(shí)間為：1h，2h，3h，4h，以未處理組為對照組。采

8、用RT-PCR法檢測CO<,2>氣腹處理后CaSki細(xì)胞中Survivin和Caspase-3 mRNA的表達(dá)變化；采用Western blot法檢測CO<,2>氣腹處理后CaSki細(xì)胞中Bcl-2和Caspase-3蛋白的表達(dá)變化；采用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測CO<,2>氣腹處理后CaSki細(xì)胞中Survivin、Bcl-2、Caspase-3及PCNA和Ki-67的表達(dá)變化。 [結(jié)果] 1．析因設(shè)計(jì)的方差分析結(jié)果顯示，CO

9、<,2>氣腹壓力和作用時(shí)間對CaSki細(xì)胞中Survivin、Bcl-2、Capase-3、PCNA和Ki-67的表達(dá)均有影響，且兩者有交互作用。 2．免疫細(xì)胞化學(xué)SP法顯示：Survivin、Bcl-2、Capase-3主要表達(dá)于細(xì)胞漿，PCNA、Ki-67主要表達(dá)于細(xì)胞核。 3．Survivin的表達(dá)變化：CO<,2>氣腹0mmHg和14mmHg處理1～2h時(shí)其Survivin的表達(dá)量與對照組相比無顯著差異(P>0.

10、05)，其余各組Survivin的表達(dá)量均明顯高于對照組(P<0.05)。在相同壓力狀態(tài)下，3～4h組Survivin的表達(dá)均明顯高于1～2h組(P<0.05)。CO<,2>氣腹維持相同時(shí)間時(shí)，三個(gè)壓力梯度中，總是以7mmHg組Survivin的表達(dá)最高，明顯高于0mmHg、14mmHg和對照組(P<0.05)。0mmHg組和14mmHg組Survivin的表達(dá)無顯著差異(P>0.05)。 4． Bcl-2的表達(dá)變化：CO<,2

11、>氣腹0mmHg組和14mmHg處理1～2h時(shí)Bcl-2的表達(dá)與對照組相比較均無顯著差異(P>0.05)，其余各組Bel-2的表達(dá)均明顯高于對照組(P<0.05)。當(dāng)壓力為7mmHg或14mmHg時(shí)，3～4h組Bcl-2的表達(dá)量明顯高于1～2h組(P<0.05)。當(dāng)CO<,2>氣腹維持相同時(shí)間時(shí)，總是以7mmHg組Bcl-2的表達(dá)最高，明顯高于0mmHg、14mmHg和對照組(P<0.05)。當(dāng)CO<,2>氣腹維持1～2h時(shí)，14mmH

12、g和0mmHg組兩組間Bel-2的表達(dá)無顯著差異(P>0.05)。當(dāng)CO<,2>氣腹維持3～4h時(shí)，14mmHg組Bcl-2的表達(dá)明顯高于0mmHg組和對照組(P<0.05)。 5．Capase-3的表達(dá)變化：CO<,2>氣腹0mmHg組Capase-3的表達(dá)與對照組相比較無顯著差異(P>0.05)，而7mmHg和14mmHg組Capase-3的表達(dá)均明顯低于0mmHg組和對照組(P<0.05)。CO<,2>氣腹處理相同時(shí)間時(shí)，

13、7mmHg和14mmHg組兩組間Caspase-3的表達(dá)無顯著差異(P>0.05)。當(dāng)壓力為0mmHg時(shí)，Caspase-3的表達(dá)隨著作用時(shí)間的延長無明顯變化(P>0.05)。當(dāng)壓力為7mmHg或14mmHg時(shí)，1～3h各時(shí)間組Caspase-3的表達(dá)無明顯差異(P>0.05)，但4h組Caspase-3的表達(dá)明顯低于1～3h組(P<0.05)。 6．PCNA的表達(dá)變化：CO<,2>氣腹0mmHg組PCNA蛋白的表達(dá)與對照組相比

14、較無顯著差異(P>0.05)，7mmHg和14mmHg組PCNA蛋白的表達(dá)均明顯高于0mmHg組和對照組(P<0.05)，以14mmHg組PCNA表達(dá)最高。此外，0mmHg和17mmHg組PCNA的表達(dá)不受處理時(shí)間的影響(P>0.05)，而當(dāng)CO<,2>氣腹壓力為14mmHg時(shí)，3～4h組PCNA的表達(dá)明顯高于1～2h組(P<0.05)。 7．Ki-67的表達(dá)變化：CO<,2>氣腹各處理組Ki-67的表達(dá)均明顯高于對照組(P<0

15、.05)。當(dāng)CO<,2>氣腹壓力為0mmHg時(shí)，Ki-67的表達(dá)不受處理時(shí)間的影響(P>0.05)。當(dāng)CO<,2>氣腹壓力為7mmHg或14mmHg時(shí)，3～4h組Ki-67的表達(dá)明顯高于1～2h組(P<0.05)。此外，無論處理時(shí)間長短，7mmHg組Ki-67的表達(dá)總是最高，14mmHg組Ki-67的表達(dá)總是高于0mmHg組而低于7mmHg組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 [結(jié)論]在一定的處理壓力和時(shí)間范圍，CO<,2>氣