VEGF-PLA納米緩釋微球SVFs對游離移植脂肪顆粒及脂肪組織工程膠原支架血管化的研究.pdf

1、研究背景:
　　 組織工程技術(shù)是近來學(xué)術(shù)界研究熱點(diǎn)，細(xì)胞療法和基因療法是組織工程研究的熱點(diǎn)，學(xué)術(shù)界一直探求一種臨床實用性強(qiáng)的安全的輔助組織工程手段。
　　 近年來，隨著脂肪抽吸術(shù)的廣泛開展和應(yīng)用，自體脂肪顆粒注射移植術(shù)已經(jīng)在國內(nèi)外得到廣泛的重視。自體脂肪顆粒以其無排斥、感染率低、注射后組織相容性好等優(yōu)點(diǎn)，是目前修復(fù)軟組織缺損比較理性的填充材料。雖然脂肪組織工程技術(shù)理論的發(fā)展，為真正實現(xiàn)無損傷修復(fù)軟組織缺損和真正意義上形態(tài)

2、、結(jié)構(gòu)與功能重建開辟了新的途徑。但是，脂肪組織工程技術(shù)目前還不能實現(xiàn)臨床應(yīng)用，所以目前修復(fù)軟組織缺損較理想的填充材料是自體脂肪顆粒。
　　 自體脂肪顆粒移植在臨床上一直備受關(guān)注，尤其是負(fù)壓抽脂術(shù)在臨床上得到廣泛的應(yīng)用之后，這種移植術(shù)被越來越多的臨床醫(yī)生和患者所接受，并在獲取、純化、注射脂肪和提高其存活率等方面不斷得到提高。但是，自體脂肪顆粒移植后吸收率可高達(dá)30％～50％，這種高吸收率的問題一直不能得到良好的解決，所以移植脂肪成

3、活率較低極大地限制了其在臨床上的廣泛應(yīng)用。脂肪組織不僅是儲存能量及內(nèi)分泌器官，還是軟組織填充理想的替代物，而且還被認(rèn)為是成體干細(xì)胞的有效來源，因為脂肪組織當(dāng)中含有多種細(xì)胞成分，包括祖細(xì)胞成分，這些祖細(xì)胞成分可分化成為其他細(xì)胞系。脂肪組織當(dāng)中主要包含脂肪細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、壁細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)成分等，其中脂肪細(xì)胞和脂肪干細(xì)胞是近年來研究的熱點(diǎn)。脂肪干細(xì)胞被認(rèn)為是一種表現(xiàn)脂肪細(xì)胞和血管細(xì)胞的祖細(xì)胞，它位于脂肪

4、細(xì)胞之間、血管周圍或細(xì)胞外基質(zhì)中，可促進(jìn)脂肪組織的轉(zhuǎn)歸。脂肪干細(xì)胞存在于脂肪組織的間質(zhì)血管碎片中（stromalvascularfraction，SVF），而SVF是干細(xì)胞輔助脂肪移植中最重要的組分。通過膠原酶消化，從脂肪組織中分離的多種細(xì)胞混合物形成的細(xì)胞團(tuán)就叫做間質(zhì)血管碎片(SVF)。間質(zhì)血管碎片中含有豐富的間充質(zhì)干細(xì)胞，可分化為多種譜系，是再生醫(yī)學(xué)、組織工程等最理想的種子細(xì)胞。
　　 選擇合適細(xì)胞外基質(zhì)支架，作為妥當(dāng)?shù)募?xì)胞

5、載體是組織工程的關(guān)鍵，是使SVFs中的ADSCs得以增殖、分化的重要條件。脂肪組織本身含有非常豐富的膠原、蛋白聚糖、纖維粘連蛋白等，這些組織是優(yōu)秀的細(xì)胞外基質(zhì)。這些年來熱門的SVFs細(xì)胞輔助脂肪轉(zhuǎn)移技術(shù)，既解決了移植脂肪中ADSCs含量低，同時又解決了移植的SVFs缺乏細(xì)胞外基質(zhì)兩個問題，并簡化了SVFs提取的體外培養(yǎng)、多次離心重懸等步驟，為臨床上解決移植脂肪吸收率高的難題提供了一種解決方法。
　　 在組織工程材料中加入有活性的

6、生長因子，能夠增強(qiáng)工程化組織的血管化，減少吸收率，提高移植組織的成活。血管內(nèi)皮生長因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)又稱為血管滲透因子，這種細(xì)胞因子具有促進(jìn)血管滲透的作用，同時還可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移、延長血管內(nèi)皮細(xì)胞壽命、促進(jìn)血管形成、增強(qiáng)血管通透性和改變細(xì)胞外基質(zhì)等作用。除了對血管的作用，它還與創(chuàng)面愈合、創(chuàng)傷組織修復(fù)、炎癥和腫瘤發(fā)生密切相關(guān)。VEGF與VEGF受體之間存在正反饋，V

7、EGF因子局部應(yīng)用可以誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞VEGF及其受體的高表達(dá)，導(dǎo)致VEGF效應(yīng)的放大。但是VEGF在體內(nèi)應(yīng)用時因其半衰期短、容易降解等因素使得不能充分發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。藥劑學(xué)的緩釋技術(shù)很好的解決這一難題，它通過微球包埋技術(shù)將VEGF包埋于聚乳酸納米微球中，從而使這種細(xì)胞因子能夠緩慢的釋放，達(dá)到對周圍環(huán)境持續(xù)發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的目的。這種緩釋技術(shù)在脂肪組織工程的研究領(lǐng)域具有很大的研究價值。
　　 近年來，組織工程技術(shù)的發(fā)展迅速，使得

8、很多臨床上的難題獲得了一種可能性的解決方案。然而，由于組織工程的血管化問題難以解決，大部分的組織工程技術(shù)距離臨床應(yīng)用還有很大距離。膠原蛋白是良好的支架材料，其已被美國FDA批準(zhǔn)作為人工皮膚材料。對于種子細(xì)胞的選擇，大部分研究都選擇脂肪干細(xì)胞。然而由于脂肪干細(xì)胞需要培養(yǎng)周期，且操作復(fù)雜，臨床應(yīng)用性不強(qiáng)。SVFs作為種子細(xì)胞，具有很多優(yōu)勢。以膠原蛋白作為支架材料，以SVFs作為種子細(xì)胞構(gòu)建工程化的脂肪組織，并且以VEGF-PLA緩釋微球作為

9、微環(huán)境細(xì)胞因子，國內(nèi)外尚未見相關(guān)報道。
　　 研究目的:
　　 1.臨床指導(dǎo)上:希望通過探討VEGF-PLA納米緩釋微球與SVFs對游離移植脂肪顆粒及脂肪組織工程膠原支架血管化的影響。探索一種臨床應(yīng)用性強(qiáng)的輔助脂肪移植和脂肪組織工程的細(xì)胞療法和基因療法手段。為下一步將科學(xué)研究應(yīng)用于臨床做好理論基礎(chǔ)。
　　 2.學(xué)術(shù)上:基因療法的細(xì)胞因子緩釋系統(tǒng)結(jié)合SVFs細(xì)胞療法對游離脂肪移植及組織工程膠原支架血管化的研究，在國

10、內(nèi)外學(xué)術(shù)界尚未見報道。本研究希望通過對其機(jī)理的探討，進(jìn)一步揭示其機(jī)理，為臨床應(yīng)用做鋪墊。
　　 本研究的創(chuàng)新點(diǎn)是，將SVFs與細(xì)胞因子緩釋系統(tǒng)相結(jié)合，聯(lián)合SVFs和（或）VEGF-PLA緩釋微球體內(nèi)構(gòu)建工程化脂肪組織及輔助脂肪移植。同類的研究在學(xué)術(shù)界尚未見報道。具體的研究目的如下。
　　 1.利用酶消化法從人脂肪組織當(dāng)中分離提取SVFs，進(jìn)行形態(tài)觀察，并進(jìn)行多向誘導(dǎo)分化，探討其干細(xì)胞特性及作為脂肪組織工程理想種子細(xì)胞的優(yōu)

11、勢。
　　 2.體外DiI熒光標(biāo)記SVFs，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞標(biāo)記情況并檢測DiI標(biāo)記對SVFs培養(yǎng)貼壁所得P0代細(xì)胞增殖和成脂分化的影響，探討DiI標(biāo)記作為細(xì)胞示蹤標(biāo)記的優(yōu)勢。
　　 3.體外構(gòu)建VEGF-PLA聚乳酸納米微球緩釋系統(tǒng)，檢測樣品包封率和載藥量，并檢測其體外緩釋能力，探討其應(yīng)用于輔助脂肪顆粒移植研究的可行性。
　　 4.設(shè)計對照組，將SVFs和（或）VEGF-PLA緩釋微球聯(lián)合脂肪顆粒移植進(jìn)行體內(nèi)

12、實驗，探討SVFs和（或）VEGF-PLA緩釋微球?qū)w內(nèi)脂肪顆粒移植成活的影響。
　　 5.以Ⅰ型膠原固態(tài)支架為載體材料，聯(lián)合SVFs和（或）VEGF-PLA緩釋微球體內(nèi)構(gòu)建工程化脂肪組織的影響，檢測其體內(nèi)構(gòu)建脂肪組織的血管化水平，為脂肪組織工程提供實驗依據(jù)。
　　 材料與方法:
　　 1.SVFs的體外分離培養(yǎng)及其培養(yǎng)所得未傳代P0代細(xì)胞多向誘導(dǎo)分化鑒定
　　 收集抽脂術(shù)患者的脂肪組織，純化后用Ⅰ型膠原

13、酶消化、過濾、離心、鋪皿進(jìn)行貼壁培養(yǎng)，觀察細(xì)胞生長狀態(tài)。用MTT法繪制細(xì)胞增殖生長曲線;用相應(yīng)的定向誘導(dǎo)液對SVFs培養(yǎng)所得未傳代P0代細(xì)胞向脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞方向誘導(dǎo)分化，并用油紅O、茜素紅和阿新藍(lán)染色進(jìn)行鑒定。
　　 2.SVFs體外DiI熒光標(biāo)記及觀察標(biāo)記物對SVFs培養(yǎng)所得未傳代P0代細(xì)胞生物性狀的影響
　　 熒光染料DiI體外標(biāo)記SVFs，倒置顯微鏡及熒光顯微鏡觀察細(xì)胞生長情況，分別用MTT法和油紅O定

14、量檢測法檢測DiI標(biāo)記后SVFs培養(yǎng)所得未傳代P0代細(xì)胞增殖能力和成脂分化能力，并與未標(biāo)記組進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)比較，分析標(biāo)記后細(xì)胞生物性狀的改變。
　　 3.體外構(gòu)建VEGF-PLA緩釋微球并檢測其載藥量、包封率及體外緩釋特性體外用超聲乳化法構(gòu)建VEGF-PLA緩釋微球，檢測微球載藥量和包封率;透射電鏡觀察微球包被情況并測量直徑;用ELISA試劑盒檢測VEGF-PLA緩釋能力，連續(xù)檢測21d，分析緩釋微球的特性，為下一步實驗提供依據(jù)。<

15、br>　　 4.SVFs及VEGF-PLA緩釋微球?qū)χ绢w粒移植影響的體內(nèi)實驗研究
　　 分組設(shè)計:第1組移植單純脂肪顆粒;第2組移植脂肪顆粒+SVFs，第3組移植脂肪顆粒+SVFs+VEGF-PLA緩釋微球;體外將SVFs用DiI熒光標(biāo)記，標(biāo)記后分別按照分組將SVFs和（或）VEGF-PLA緩釋微球與脂肪顆?；靹颍^察混勻后的性狀，無菌條件下將混合物通過注射的方式隨機(jī)注射入裸鼠皮下，每只裸鼠注射3個點(diǎn)。8w后取出移植物，準(zhǔn)確

16、測量濕重，記錄數(shù)據(jù)并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)比較，組織切片經(jīng)HE和CD34及VEGF免疫組化染色分析，觀察移植后脂肪顆粒存活情況，并觀察CD34和VEGF的表達(dá)情況，顯微鏡下計數(shù)三組毛細(xì)血管數(shù)量，并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)比較，分析SVFs和VEGF-PLA緩釋微球?qū)σ浦参镅芑挠绊憽?br>　　 5.VEGF-PLA緩釋微球促進(jìn)工程化脂肪組織血管化的影響研究
　　 準(zhǔn)備三組移植物，1組為SVFs+膠原支架，未體外成脂誘導(dǎo)。2組為SVFs+膠原支架，3

17、組為SVFs+膠原支架+VEGF-PLA緩釋微球，2組和3組體外成脂誘導(dǎo)3天后進(jìn)行裸鼠體內(nèi)移植，三組移植同一只裸鼠皮下;分別于4w后取出新生標(biāo)本，通過大體觀察、測量濕重、HE染色觀察新生組織結(jié)構(gòu)和血管生長情況，高倍鏡下計數(shù)新生毛細(xì)血管密度，收集數(shù)據(jù)并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)比較分析。
　　 統(tǒng)計學(xué)處理:
　　 所得數(shù)據(jù)均采用SPSS16.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計分析，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(（x）±s)表示。P＜0.05差異有統(tǒng)計學(xué)差異。SVFs培養(yǎng)

18、貼壁生長曲線（OD值）采用曲線擬合方法分析。DiI標(biāo)記對細(xì)胞增殖能力影響采用重復(fù)測量的方差分析。DiI標(biāo)記后對SVFs培養(yǎng)所得未傳代P0代細(xì)胞成脂能力影響采用獨(dú)立樣本T檢驗。透射電鏡和圓二色譜法測緩釋微球直徑的比較采用獨(dú)立樣本T檢驗。體內(nèi)脂肪移植物濕重比較采用單因素方差分析。體內(nèi)脂肪移植物血管數(shù)比較采用單因素方差分析。組織工程新生物濕重比較采用單因素方差分析。組織工程新生物血管數(shù)比較比較采用單因素方差分析。
　　 結(jié)果:

19、　　 1.從抽脂術(shù)患者得到的脂肪組織當(dāng)中成功分離得到SVFs，貼壁生長后形態(tài)類似于成纖維細(xì)胞，具有很強(qiáng)的分裂增殖能力，3至7天時細(xì)胞增殖快速。對所測的OD值進(jìn)行曲線擬合方法分析，用Quadratic模型，R2=0.965，回歸方程檢驗有統(tǒng)計學(xué)意義(F=503.047,P=0.000)。用成脂、成骨、成軟骨定向分化誘導(dǎo)液誘導(dǎo)2～3周后，分別用油紅O、茜素紅、阿新藍(lán)染色呈陽性反應(yīng)。
　　 2.體外用DiI成功標(biāo)記SVFs，標(biāo)記后細(xì)

20、胞呈現(xiàn)較強(qiáng)的紅色熒光，標(biāo)記率較高，標(biāo)記后細(xì)胞成活率較高，達(dá)（92.31±1.52）％。與正常的SVFs成活率(92.73±0.57)％并無差異。兩組進(jìn)行獨(dú)立樣本T檢驗。經(jīng)方差齊性分析，兩組樣本的方差不齊(F=5.396，P=0.043)。兩個樣本之間的均值差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=-0.631，P=0.550)，DiI標(biāo)記對SVF細(xì)胞成活率無影響。
　　 對OD值進(jìn)行重復(fù)測量分析。Mauchly'sTestofsphericity檢

21、驗Mauchly'sW為0.001，P=0.018，7次測量的OD值存在相關(guān)性。TestofwithinsubjectsEffects(Greenhouse-Geisser校正)見時間因素P=0.000。時間和分組作用P=0.524，F(xiàn)=0.693?？梢姇r間因素的作用有統(tǒng)計學(xué)意義，測量指標(biāo)有隨時間變化而變化的趨勢，而時間因素的作用不受分組因素影響。TestofBetween-SubjectsEffects分組作用的F=0.062，P=0

22、.810，可見分組因素不起作用，兩組無區(qū)別。每個檢測點(diǎn)DiI標(biāo)記組和未標(biāo)記組OD值差異無統(tǒng)計學(xué)意義(每個點(diǎn)P＞0.05詳見表2-2)。重復(fù)測量分析兩組OD均數(shù)變化趨勢，2組幾乎重疊(詳見圖2-3)，以上的分析結(jié)果可見DiI標(biāo)記對SVFs貼壁培養(yǎng)的P0代細(xì)胞增值能力無影響。DiI標(biāo)記后對SVFs培養(yǎng)所得未傳代P0代細(xì)胞成脂能力也沒有太大的影響，兩組進(jìn)行獨(dú)立樣本T檢驗。經(jīng)方差齊性分析，兩組樣本的方差齊(F=0.794，P=0.399)。兩個

23、樣本之間的均值差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=1.562，P=0.157），DiI標(biāo)記對SVF細(xì)胞成活率無影響。
　　 3.體外成功構(gòu)建VEGF-PLA緩釋微球，微球表面光滑、球體大小均勻、形態(tài)飽滿;微球直徑平均為(27.56±4.60)nm;微球樣品包封率為(89.24±1.24)％，計算樣品的載藥量為:{(17.85±0.25)×10-3}％;通過ELISA方法檢測微球緩釋特性，21d內(nèi)微球可緩慢釋放VEGF，第21d累計釋藥率為80

24、.35％。將微球稀釋后在透射電鏡下測量其直徑為(28.30±4.64)nm。與利用圓二色譜法測量微球直徑法比較。兩組進(jìn)行獨(dú)立樣本T檢驗。經(jīng)方差齊性分析，兩組樣本的方差齊(F=0.033，P=0.860)。兩個樣本之間的均值差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.253，P=0.253），兩種測量方法無差異。
　　 4.將3組混合物移植裸鼠體內(nèi)8w后，裸鼠全部成活，移植物清晰可見。1組、2組和3組平均濕重分別為:(0.077±0.119)g;(

25、0.159±0.016)g;(0.182±0.120)g。3組數(shù)據(jù)方差齊性檢驗，P=0.946，方差具有齊性。3組數(shù)據(jù)有顯著性差異，3組間比較，F(xiàn)=167.678，P=0.000，3組數(shù)據(jù)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。第3組濕重高于第2組(P=0.001)。第2組濕重高于第1組(P=0.000)。組織切片HE染色顯示第3組脂肪細(xì)胞成活率最高，纖維性成分最少，第2組次之，第1組內(nèi)部纖維性成分最多;免疫組化結(jié)果同樣是第3組表達(dá)最強(qiáng)，第2組次之，第1組

26、最少。血管密度計數(shù)經(jīng)統(tǒng)計學(xué)比較分析，第1、2、3組平均新生血管數(shù)量分別為:(7.25±1.83)個/HP;(12.65±1.69)個/HP;(14.75±2.02)個/HP;3組數(shù)據(jù)方差齊性檢驗，Levenestatistic為0.256，P=0.775，方差具有齊性。組間比較，F(xiàn)=87.048，P=0.000，3組數(shù)據(jù)有顯著性差異。第3組血管數(shù)多于第2組(P=0.000)。第2組血管數(shù)多于第1組(P=0.001)。
　　 5.

27、三組移植物移植裸鼠體內(nèi)4w后，動物全部成活，第2組和第3組成功構(gòu)建出脂肪組織。新生物濕重測定，術(shù)后4w時三組濕重分別為:(23.28±3.86)mg，(31.16±2.19)mg，(36.67±1.60)mg，運(yùn)用SPSS軟件進(jìn)行單因素方差分析，首先進(jìn)行方差齊性檢驗，Levenestatistic為3.044，P=0.069，方差具有齊性。三組濕重比較，差異具有顯著性(F=48.768，P=0.000)。1組比2組輕，差異具有顯著性(P

28、=0.000)。2組比3組輕，差異具有顯著性(P=0.001)。4w時第1組、2組和3組新生毛細(xì)血管密度平均分別為(1.81±0.83)個/HP，(2.62±0.89)個/HP，(3.44±1.09)個/HP。Levenestatistic檢驗，方差具有齊性(P=0.318)。Levenestatistic為1.177，方差具有齊性(P=0.318)。三組比較F=11.846，差異具有顯著性(P=0.000)。1組比2組血管少，差異具有

29、統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.019)。2組比3組血管少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＝0.019)。可見VEGF-PLA緩釋微球聯(lián)合SVFs能夠明顯促進(jìn)膠原支架體內(nèi)成脂和血管化水平。
　　 結(jié)論:
　　 1.抽脂術(shù)獲得的脂肪組織能夠成功分離提取大量的多能干細(xì)胞，經(jīng)形態(tài)學(xué)、及多向分化鑒定證實為干細(xì)胞成分。該細(xì)胞容易獲取、來源豐富、在相應(yīng)的誘導(dǎo)條件下能夠分化成為目的細(xì)胞，可作為脂肪組織工程理想的種子細(xì)胞。
　　 2.DiI標(biāo)記是一

30、種較好的細(xì)胞示蹤方式，標(biāo)記后細(xì)胞成活率較高，不會影響SVFs培養(yǎng)所得未傳代P0代細(xì)胞的增殖和成脂分化的能力。
　　 3.將VEGF包被于PLA微球中，可以使微球中VEGF緩慢釋放進(jìn)入局部微環(huán)境，從而達(dá)到VEGF對周圍細(xì)胞持續(xù)發(fā)揮作用的目的。
　　 4.SVFs和VEGF-PLA緩釋微球體內(nèi)能夠明顯促進(jìn)脂肪顆粒的成活率，同樣能夠明顯促進(jìn)脂肪顆粒移植血管化的水平，是一種輔助脂肪顆粒移植理想的種子細(xì)胞和細(xì)胞因子緩釋劑。