利用PPF1基因延緩葉片衰老和幾個(gè)水稻生殖相關(guān)突變體的研究.pdf

1、本研究把來(lái)源于豌豆的通過(guò)控制葉綠體發(fā)育影響植物發(fā)育進(jìn)程的PPFl基因?qū)胨?，以期獲得衰老延緩的轉(zhuǎn)基因水稻。同時(shí)，本文從菌株互作及菌株?duì)顟B(tài)、脫菌培養(yǎng)、干燥培養(yǎng)、分化和移栽等因素入手對(duì)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化水稻過(guò)程中的諸多影響因素進(jìn)行了探討。歸納如下： 1．利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，把短日豌豆花后特異表達(dá)、具有延緩衰老作用的基因PPFl轉(zhuǎn)入水稻。約970塊未成熟胚性愈傷組織與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)后，得到了約280塊抗性愈傷，從中分化出抗性綠苗54株。

2、 2．PCR、Southern blotting檢測(cè)結(jié)果表明外源基因已經(jīng)插入受體基因組，其中42株含有目的基因，陽(yáng)性率為77.7％。部分陽(yáng)性植株的葉綠素含量和光合指標(biāo)分析表明，多數(shù)轉(zhuǎn)基因植株明顯高于對(duì)照。 3．在T<,3>代轉(zhuǎn)基因植株中發(fā)現(xiàn)一個(gè)葉片衰老進(jìn)程顯著受到抑制的轉(zhuǎn)基因株系line 269。PCR、Southern blotting分析發(fā)現(xiàn)該株系為一個(gè)單位點(diǎn)插入系，PPFl基因位點(diǎn)在轉(zhuǎn)基因株系內(nèi)已經(jīng)純合，并能夠作為單個(gè)孟德

3、爾因子在水稻中遺傳。RT-PCR分析結(jié)果顯示PPF1基因能夠在該株系內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)。生理指標(biāo)測(cè)定證實(shí)上三葉葉綠素含量、凈光合速率和氣孔導(dǎo)度均較對(duì)照顯著提高。 4．兩個(gè)獨(dú)立時(shí)期的葉色觀察表明，該株系同位葉的葉色明顯較對(duì)照青綠，對(duì)應(yīng)葉片的衰老值差異均在1左右，顯示出源足的高光效特征。同時(shí)，轉(zhuǎn)基因株系的穩(wěn)重、千粒重、單株產(chǎn)量均較對(duì)照有顯著的提高，結(jié)實(shí)率提高達(dá)極顯著水平。這些結(jié)果證實(shí)PPF1基因在轉(zhuǎn)基因純系中的表達(dá)使植株衰老延緩。作為結(jié)果，

4、轉(zhuǎn)基因植株的產(chǎn)量在一定程度上得到了提高。 5．以3個(gè)秈稻和2個(gè)粳稻品種為對(duì)象，對(duì)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化水稻過(guò)程中影響轉(zhuǎn)化效率的因素進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，AGL1和EHA105按一定比例混合共轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化前菌體重懸對(duì)抗性愈傷率有顯著影響；瓊脂粉加倍和超凈工作臺(tái)上風(fēng)干4h能明顯提高抗性愈傷率和分化率；分化培養(yǎng)基中加入二甲基椏楓(DMSO)或脯氨酸(pro)可以提高分化率；壯苗時(shí)加入適量的NAA有利于壯根并提高移栽成活率。應(yīng)用此農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，獲得

5、了一批經(jīng)PCR和點(diǎn)雜交鑒定的轉(zhuǎn)基因植株。 植物的生殖生長(zhǎng)是非常重要的發(fā)育過(guò)程，此階段的任何異常都可能導(dǎo)致植物的繁衍障礙。本文對(duì)幾個(gè)來(lái)自于秈稻的生殖發(fā)育突變體進(jìn)行了形態(tài)鑒定、解剖觀察、細(xì)胞觀察和遺傳分析等，以期認(rèn)識(shí)突變性狀的特性及原因。同時(shí)利用SSR標(biāo)記結(jié)合群分法對(duì)部分突變基因進(jìn)行了染色體定位，希望為水稻的生殖生物學(xué)的深入研究奠定基礎(chǔ)。 1. 利用一個(gè)從秈型恢復(fù)系蜀恢202中發(fā)現(xiàn)的自然不育突變株作為材料，通過(guò)形態(tài)鑒定、正反

6、雜交、胚囊細(xì)胞觀察和傳粉生物學(xué)鑒定，初步確定了該突變體的類型和突變產(chǎn)生的直接原因.同時(shí)，以該突變性狀的遺傳特性進(jìn)行了分析，并利用網(wǎng)上公布的SSR系列引物和相關(guān)基因組序列，對(duì)該基因進(jìn)行了精細(xì)的染色體定位。主要結(jié)果如下： 1)突變體自然結(jié)實(shí)率為2.9％，最高不超過(guò)5％；當(dāng)以突變體為母本分別與202R、9311、D62B、527R、881R等雜交時(shí)，不能得到雜交種子，即便幾種花粉混合授粉，其結(jié)實(shí)率也仍然為零；然而，反交平均結(jié)實(shí)率為36

7、.7％。解剖觀察發(fā)現(xiàn)，突變體和野生型小花之間沒(méi)有發(fā)現(xiàn)顯著的差異；碘染鏡檢顯示突變體的花粉在外型和染色深度上與野生型接近，可育率均在85.7％左右。表明該突變體是一個(gè)雌性器官特異性的不育突變體，該突變并不影響雄配子體的功能。 2)成熟胚囊觀察結(jié)果顯示，90％以上的突變體成熟胚囊具有完整的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。卵器數(shù)目正常、極性明顯、位置正常，呈現(xiàn)典型的蓼型結(jié)構(gòu)，雌雄器官的發(fā)育是同步。但是，我們未能觀察到精細(xì)胞進(jìn)入胚囊以及胚和胚乳的形成、發(fā)育。

8、相反，我們發(fā)現(xiàn)了未經(jīng)受精作用的卵細(xì)胞的解體。這些結(jié)果提示突變體的敗育可能發(fā)生在受粉階段。 3)熒光顯微觀察發(fā)現(xiàn)突變體花粉粒在開(kāi)花后3-5分鐘即開(kāi)始萌發(fā)，隨即開(kāi)始進(jìn)入柱頭。20分鐘時(shí)，突變體的花粉管在花柱中的延伸速度明顯低于野生型。隨后，突變體花粉管在花柱疏導(dǎo)組織中的生長(zhǎng)卻被異常地阻斷。具體的幾種畸形可以歸納如下：A，花粉管頂端氣泡狀彭大；B，花粉管頂端彎曲，逆向生長(zhǎng)；C，頂端凝聚，扭曲生長(zhǎng)； D，花粉管頂端分叉，停止生長(zhǎng)。由此表

9、明該突變體是由于花粉管在花柱疏導(dǎo)組織中生長(zhǎng)受阻、不能完成正常的雙受精過(guò)程而最終導(dǎo)致不育。 4)多個(gè)組合的雜種F1全部表現(xiàn)正?？捎?，F(xiàn)2群體出現(xiàn)育性分離，且可育株與不育株的比例均符合3:1的分離比，回交群體均基本符合1:1的分離比，表明該雌不育性狀為一對(duì)基因控制的隱性突變。由于此類基因尚屬首次報(bào)道，將該基因暫時(shí)命名為PTBFS(t). 5)首先選用圭630×fs-202R的F2群體作為作圖群體對(duì)該基因進(jìn)行定位。差異標(biāo)記連鎖

10、分析發(fā)現(xiàn)位于第5染色體短臂上的SSR標(biāo)記RMl53、RMl22、RM13、RM413、RM592、RM405、RM437、RMI 69、和RM289與突變性狀存在連鎖關(guān)系，遺傳距離分別為28、26、1.5、1.5、0、3.1、8.9、27.9、32.1CM。因此，PTBFS(t)基因被首先定位在標(biāo)記RM413和RM405之間，遺傳距離為4.8 CM，且與RM592表現(xiàn)共分離。RM413和RM405之間的物理距離在日本晴數(shù)據(jù)上為890K。

11、利用公布的水稻基因組序列，在此區(qū)域內(nèi)設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)SSR和InDel s標(biāo)記，并利用擴(kuò)大的F2群體進(jìn)行連鎖分析，進(jìn)一步把基因定位在RL85和RL167之間，其間的物理距離為130K.同時(shí)，我們?cè)诮M合9311×fs-202R(隱性單株310株)和多1x fs-202R F：(隱性單株106株)中進(jìn)行定位分析。3個(gè)群體定位結(jié)果整合，我們成功地把PTBFS(t)基因整合在標(biāo)記RL33和RD19之間，其間的物理距離為72K.同時(shí)在此區(qū)域內(nèi)，標(biāo)記RL6

12、0、RD2、RD1與不育基因表現(xiàn)共分離。 6)采用TIGR Rice BrowSe引擎，以日本晴數(shù)據(jù)為參照，對(duì)上述定位的區(qū)段進(jìn)行了基因預(yù)測(cè)，檢索至4 10個(gè)TlGR Rice Loci。經(jīng)TIGR Rice Transcript Assemblies，Rice FL-cDNA和多種微陣列探針電子雜交以及對(duì)蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)的相似性搜索，可以證實(shí)此10個(gè)預(yù)測(cè)位點(diǎn)為具備轉(zhuǎn)錄、表達(dá)特性的基因。同時(shí)發(fā)現(xiàn)3個(gè)基因LOC-Os05g05270，LO

13、C-Os05g05320和LOC-Os05g05340和數(shù)據(jù)庫(kù)中可能參與傳粉受精過(guò)程的EST或蛋白具有一定同源性。據(jù)此我們把此3個(gè)基因作為初步的候選基因，并對(duì)其結(jié)構(gòu)和功能作了初步預(yù)測(cè)。 2。利用一個(gè)來(lái)源于農(nóng)家品種自然突變的花器官突變體進(jìn)行了解剖觀察、掃描電鏡觀察、遺傳分析，同時(shí)對(duì)它和以前報(bào)道的相關(guān)突變體可能關(guān)系進(jìn)行了分析，主要結(jié)果如下： 1)突變體表現(xiàn)為內(nèi)外孵變長(zhǎng)，頂端不抱合，中間著生1-2朵小花，雄蕊和雌蕊的數(shù)目異常，

14、內(nèi)外孵間著生1-6個(gè)孵片類似物，結(jié)實(shí)率下降，其中約有3.5％的小花著生2粒種子。結(jié)合前人研究，我們把它命名為SRS2。 2)解剖觀察發(fā)現(xiàn)，約有60％的突變體穎花的內(nèi)外孵之間含有2朵未完全發(fā)育的小花。其中，漿片轉(zhuǎn)化成的孵片類似物作為兩朵畸形小花的間隔；小花的雄蕊不同程度地減少，雌蕊增加，有的發(fā)現(xiàn)有一團(tuán)雌蕊抱合的現(xiàn)象。約有40％穎花含有一朵不完全小花和數(shù)片互生或鄰生的孵片類似物。花期碘染結(jié)果顯示突變體花粉可育率為67.6％，與野生型

15、(92.3％)相比明顯下降。 3)SRS2突變體的花器官分化過(guò)程按最終產(chǎn)生一朵或兩朵小花而明顯區(qū)別。前者在分化早期整個(gè)穎花原基呈現(xiàn)三角形不規(guī)則發(fā)育，而此時(shí)產(chǎn)生雙花的穎花原基則半邊收縮。雌雄蕊分化中期，單花突變體開(kāi)始不規(guī)則的出現(xiàn)雄蕊原基和心皮，并在雌蕊原基周圍靠近外孵一側(cè)產(chǎn)生一至數(shù)枚漿片；此期間的雙花突變體則從中部產(chǎn)生縊痕，開(kāi)始不均等分裂，形成一大一小的兩個(gè)穎花原基。中間的縊痕繼續(xù)收縮分裂，逐漸形成間隔兩花的孵片類似物。與此同時(shí)，

16、分隔的兩花原基逐漸出現(xiàn)雌雄蕊原基的分化。 4)多個(gè)F。群體和回交群體的突變性狀遺傳分析顯示，所有的F1均表現(xiàn)正常，F(xiàn)2群體突變性狀發(fā)生分離，且均符合3:1的分離比例，而回交群體均基本符合1:1的分離比例，表明該突變性狀為一對(duì)基因控制的隱性突變。 3. 對(duì)一個(gè)從秈稻雜交組合的后代中發(fā)現(xiàn)的一例雄性核不育材料進(jìn)行了初步的鑒定、遺傳分析和分子標(biāo)記定位，主要結(jié)果如下： 1)突變體植株株高降低，葉色濃綠，自然結(jié)實(shí)率在10％左

17、右，套袋結(jié)實(shí)率為0。小花的解剖觀察發(fā)現(xiàn)，突變體小花花絲細(xì)長(zhǎng)，花藥干癟，呈白色且透明，但雄性器官的數(shù)量和雌性器官正常.碘染證實(shí)，突變體的花藥壁內(nèi)沒(méi)有花粉粒著色，因此被認(rèn)為是一個(gè)典型的無(wú)花粉型雄性不育材料，并命名為ms-np。 2)突變性狀在各種背景下的分離結(jié)果表明，所有群體的F1植株均表現(xiàn)正?？捎?，F(xiàn)2或BClFI出現(xiàn)育性分離，說(shuō)明該育性基因受核基因控制而不受胞質(zhì)基因組的影響，可育相對(duì)不育為顯性.在所有F<,2>群體中，育性分離均