冠心病患者單核細胞CX3CR1表達的研究及辛伐他汀的干預作用.pdf

1、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(coronaryheartdisease，CAD)是一種多種因素共同作用而導致的心血管疾病，其病理機制至今尚未完全闡明。自從19世紀中葉Virchow學者提出慢性炎癥和纖維細胞增殖作為AS損傷病理機制的概念以來，愈來愈多的臨床和動物實驗證明，炎癥和免疫反應可引起的血小板、白細胞翻附和聚集以及遷移以致于血管內皮損傷，在動脈粥樣硬化(AS)的形成中發(fā)揮重要作用，被認為是心血管疾病的獨立危險因素。1999年Ross提

2、出“動脈粥樣硬化是血細胞、紊亂血流和血管壁之間的動態(tài)相互作用的結果，是一種高度特異性的細胞分子反應為特征的炎癥進程”。他將動脈粥樣硬化定義為慢性炎癥過程得到大家的認同。著名的“損傷-反應”學說中概括了動脈粥樣硬化斑塊形成的過程：“內皮功能低下→內皮受損→特異分子釋放→單核細胞和T細胞粘附集聚→遷移至內膜下→巨噬細胞、吞噬脂質→泡沫細胞、TC→脂斑→促凝作用→血管活性分子、生長因子、細胞介素→持續(xù)炎癥反應→平滑肌細胞遷移和炎癥細胞交織→斑

3、塊形成→血管壁增厚(重構代償性反應機制)→大量巨噬細胞和淋巴細胞聚集→斑塊增大→軟質斑塊和壞死脂質核由纖維帽覆蓋→成熟斑塊形成?！背墒彀邏K在炎性分子的作用下可破裂和出血、血栓形成，即心臟急性事件發(fā)生的病理機制。由此可見，內皮細胞在危險因素作用下出現(xiàn)功能改變而表達多種炎癥趨化物，誘導白細胞黏附及浸潤內皮，單核細胞在動脈粥樣硬化斑塊形成中起著中心環(huán)節(jié)作用。 而在上述病理過程中，有一些趨化因子能夠促使上述反應發(fā)生，所以這些趨化因子被認

4、為是動脈粥樣硬化的危險因素之一。那么，趨化因子在動脈粥樣硬化的形成和發(fā)展過程中到底起什么作用呢?首先，在AS的形成過程中，內皮細胞和活化的單核細胞、T細胞表面表達的黏附分子之間相互作用，從而使這些炎癥細胞穿過內皮進入受損的血管壁；之后，在趨化因子的作用下單核一巨噬細胞和T細胞進一步活化、增殖并在損傷局部聚集；動脈粥樣硬化斑塊中的某些物質，如氧化的低密度脂蛋白(ox-LDL)可能具有抗原性，在局部引起單核-巨噬細胞和T細胞介導的免疫反應。

5、因此，炎癥細胞在動脈粥樣硬化這一慢性炎癥反應中功能的發(fā)揮依賴于多種趨化因子。 炎癥內皮釋放一種新的趨化因子FKN(Fraetalkine)能與其受體CX3CR1結合，CX3CR1是新發(fā)現(xiàn)的CX3C趨化因子fractalkine的特殊受體，是跨膜結構域受體，它介導健康細胞黏附到fractalkine并不需要G蛋白激活，而且以不依賴選擇素和整合素的方式捕獲或吸引白細胞緊密黏附。趨化因子FKN與其受體CX3CR1結合引發(fā)Gi蛋白偶聯(lián)的

6、信號轉導，并以劑量依賴的方式增強表達該受體自然殺傷細胞(NK)的殺傷力，從而導致內皮細胞損失，而且還可以是表達CX3CR1的單核細胞、淋巴細胞等產生方向性遷移信號，向血管內皮細胞趨化、黏附，并有效跨越血管向血管內皮下特定部位遷移，最終促使動脈粥樣硬化的形成。由此可見，任何影響CX3CR1表達水平的因素都有可能影響白細胞的流動并導致相應的疾病如冠心病。因此，通過對外周血單核細胞上CX3CR1表達水平的研究可能有助于早期診斷動脈粥樣硬化性心

7、臟病，并且對其嚴重程度及預后做出一定的評估。 他汀類藥物是目前臨床上有效的降血脂藥物之一，近年來大量的實驗及臨床研究表明，該類藥物除具有顯著的降血脂作用外，還有其他抗動脈粥樣硬化作用。它作為心腦血管病一級或二級預防治療，都明顯降低心腦血管疾病的發(fā)生率和病死率，改善冠心病患者介入治療的預后。研究表明，他汀類藥物在動脈粥樣硬化形成的各個環(huán)節(jié)均發(fā)揮作用。1)改善內皮功能。他汀類藥物通過上調舒血管物質，增強內皮對舒血管物質敏感性以及減少

8、上調內皮源性一氧化氮合成酶(eNOS)的表達，增加eNOSmRNA的穩(wěn)定性，減少ox-LDL對eNOS的負向調節(jié)。2)抑制炎癥。他汀類藥物通過降低細胞間黏附分子-1(ICAM-1)、炎癥相關因子和蛋白分子的表達抑制炎癥反應。而FKN-CX3CR1系統(tǒng)具有趨化和黏附的功能，他汀類藥物是否通過抑制該通路來抑制炎癥反應成為本研究的一個內容。3)抑制平滑肌細胞增殖，促進平滑肌細胞凋亡。4)穩(wěn)定斑塊的作用。他汀類藥物能減少脂質沉積，減少泡沫細胞的

9、形成，起到穩(wěn)定斑塊的作用。5)抑制血栓形成。他汀類藥物從抑制血小板活性、減少血小板聚集、提高血液纖溶活性和抑制凝血等途徑抑制血小板形成。 為了進一步研究動脈粥樣硬化斑塊形成、發(fā)展的機制，本實驗擬通過具有黏附和趨化作用的FKN的獨特受體CX3CR1在冠心病患者外周血單核細胞的表達情況，來進一步闡述冠狀動脈粥樣硬化性斑塊的形成與炎癥有關。同時，又分別通過細胞及臨床實驗研究他汀類藥物-辛伐他汀除降脂外的其他作用。 本實驗分為三

10、個部分。首先，通過流式細胞技術，檢測CX3CR1在冠心病患者外周血單核細胞上的表達。接著，采用體外細胞共培養(yǎng)實驗，通過逆轉錄聚合酶鏈反應(reversetranscription-polymerasechainraction，RT-PCR)、實時熒光定量PCR(Real-timePCR)和蛋白質免疫印跡法(Westernblotting)等方法，研究辛伐他汀對CX3CR1表達的影響及其與健康人的差異。最后通過臨床對冠心病患者應用辛伐他汀

11、藥物，探討辛伐他汀對CX3CR1表達的影響。結果分述如下： 一、CX3CR1冠心病患者單核細胞上的表達： 分別入選臨床上冠脈造影正常的對照組、具有胸痛癥狀而造影正常的不明原因胸痛組、穩(wěn)定性心絞痛組和急性冠脈綜合癥組，共120例患者。提取所有患者外周血單核細胞后，用PE標記的CX3CR1抗體標記，通過流式細胞技術檢測CX3CR1的表達情況。本實驗結果顯示，冠心病患者CX3CR1表達水平高于正常對照組[正常對照組為(0.46

12、±0.272)％、穩(wěn)定性心絞痛組為(12.59±6.049)、急性冠脈綜合癥為(38.77±13.225)]；且急性冠脈綜合征患者CX3CR1表達高于穩(wěn)定型心絞痛患者，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；且冠心病患者CX3CR1表達水平與Gensini積分呈顯著正相關(r=0.913，P<0.01)。這些說明，患者CX3CR1表達水平越高，冠狀動脈病變程度越嚴重，并且與Gensini積分呈顯著正相關性。 二、辛伐他汀對急性冠脈綜合

13、癥患者單核細胞CX3CR1表達的影響： 選取經過冠脈造影確診為急性冠脈綜合癥的住院患者作為研究對象試驗組，共63例。所有研究對象檢查前4周無感染外傷史。提取所有患者外周血單核細胞后，分為3個組：(1)對照組；(2)Sim組：分別加入10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/LSim；(3)10-5mol/LSim作用不同時間組：分別作用4、8、12h。本實驗結果顯示：1)辛伐他汀濃度越高CX3CR1的表達量就越少，

14、各濃度組之間的相對熒光量差異有統(tǒng)計學意義(F=28.439,P=0.000)。2)經重復測量方差分析，在“對照”、“4h”、“8h”、“12h”4種不同作用時間下，相對熒光量相對熒光量有差異(F=83.274，P=0.000)。各組間兩兩比較，除“4h”和“8h”之間相對熒光量無顯著性差異外(P=0.280)，其他各作用時間組間差異均有顯著性意義(P<0.01)。說明辛伐他汀可以降低CX3CR1的表達，并且呈濃度和時間依賴性。

15、三、臨床應用辛伐他汀對冠心病患者CX3CR1表達影響的研究： 選擇因心前區(qū)疼痛入院后經過冠脈造影確診為冠心病6個月后復查的患者作為研究對象試驗組，共80例。此前已經規(guī)律的臨床服用辛伐他汀6個月，將其用藥前后的血脂及CX3CR1表達情況做對比。實驗結果顯示：1)冠心病患者經過6個月的辛伐他汀臨床治療，血脂各項指標治療前后均有變化；TC治療前后t=26.988，P=0.000；TG治療前后t=13.163，P=0.000；HDL-C

16、治療前后t=-16.591，P=0.000；LDL-C治療前后t=19.051，P=0.000；差異有顯著意義，可認為服用辛伐他汀后對冠心病患者血脂水平有改善。2)辛伐他汀對CX3CR1的表達有影響，可降低其表達，治療后CX3CR1的相對拷貝數與治療前比較有顯著差異(t=-8.437，P=0.000)?；颊叩难矫黠@改善，CX3CR1的表達也減少；說明辛伐他汀可以抑制CX3CR1的表達。 通過上述三個部分的實驗，我們能夠得出

17、以下結論：1)冠狀動脈粥樣硬化是一個炎癥損傷的過程。2)CX3CR1是冠狀動脈粥樣硬化形成、發(fā)展的相關因子，CX3CR1表達水平越高，冠狀動脈病變程度越嚴重。3)細胞和臨床實驗證明辛伐他汀除降脂作用外，還有抗炎作用；它可以降低CX3CR1的表達，并且呈濃度和時間依賴性。 綜上所述，CX3CR1表達水平可作為反映冠狀動脈粥樣硬化程度和數量的指標，用以評估冠狀動脈的病變情況。辛伐他汀可降低CX3CR1的表達，從而減慢炎癥細胞的遷移速