奶山羊表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)基因CDs區(qū)的克隆分析與功能的初步研究.pdf

1、表皮生長(zhǎng)因子受體(Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR)屬于受體酪氨酸激酶，在哺乳動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程有重要的調(diào)節(jié)作用。EGFR通過(guò)激活mTOR信號(hào)通路調(diào)節(jié)脂肪酸和膽固醇的合成，脂肪酸和膽固醇合成相關(guān)基因反過(guò)來(lái)對(duì)EGFR也發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。EGFR的研究熱點(diǎn)主要集中在腫瘤癌癥領(lǐng)域，而在脂肪酸代謝領(lǐng)域的研究較少，在反芻動(dòng)物如奶山羊和奶牛上更是鮮見(jiàn)類(lèi)似報(bào)道。
　　本研究通過(guò)克隆得到了山羊EGFR基因CDs

2、區(qū)序列。原核表達(dá)截短型EGFR蛋白，制備了兔抗山羊EGFR多克隆抗體。成功包裝Ad-EGFR重組腺病毒并合成針對(duì)EGFR基因的siRNA序列，通過(guò)RT-qPCR檢測(cè)EGFR基因過(guò)表達(dá)和干擾后對(duì)山羊原代乳腺上皮細(xì)胞脂質(zhì)合成相關(guān)基因的影響，以期通過(guò)本研究為EGFR基因?qū)θ槌煞执x調(diào)控機(jī)理的研究奠定理論基礎(chǔ)。獲得的主要研究成果如下:
　　(1)克隆得到奶山羊EGFR基因CDs區(qū)序列3627bp，編碼1208個(gè)氨基酸。EGFR蛋白的第24

3、和25個(gè)氨基酸之間為信號(hào)肽切割位點(diǎn)，N端區(qū)域具有較強(qiáng)的疏水性，C端具有較強(qiáng)的親水性。奶山羊泌乳前期和泌乳后期EGFR基因的表達(dá)量最高，干奶期的表達(dá)量最低。
　　(2)克隆得到截短型EGFR蛋白(ECD)，并構(gòu)建pET-32a(+)-ECD原核表達(dá)載體，該載體轉(zhuǎn)化BL21大腸桿菌后37℃，0.8mmol/L IPTG誘導(dǎo)6h得到重組蛋白，重組蛋白純化效果良好。iELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)抗血清效價(jià)高達(dá)1∶16000，Western blot

4、檢測(cè)呈現(xiàn)較好的抗體特異性。
　　(3)成功構(gòu)建并包裝得到重組腺病毒Ad-EGFR，感染山羊原代乳腺上皮細(xì)胞36h，F(xiàn)ASN、ACC、LXRα、LXRβ、SREBP1、SCD1、ACSS1、DGAT1、DGAT2和SP1基因表達(dá)量顯著上調(diào)(P＜0.05)，F(xiàn)ABP3基因表達(dá)量顯著下調(diào)(P＜0.05)。Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，感染重組腺病毒Ad-EGFR36h以上乳腺上皮細(xì)胞中EGFR蛋白顯著表達(dá)，而且EGFR蛋白能夠被組成

5、性激活。
　　(4)成功合成針對(duì)EGFR基因的siRNA序列，轉(zhuǎn)染山羊原代乳腺上皮細(xì)胞24h后通過(guò)RT-qPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)ACSL1、DGAT2、PRLR和LF基因顯著上調(diào)(P＜0.05)，SCD1、FASN、ACC、LXRα、LXRβ和SP1基因顯著下調(diào)(P＜0.05)，而乳鐵蛋白的表達(dá)呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)(P＜0.05)。
　　綜上所述:本研究成功克隆得到了EGFR基因的CDs區(qū)序列，并通過(guò)該序列原核表達(dá)出截短型EGFR蛋白，制備