Bak和Bcl-xL及細(xì)胞凋亡與豚鼠形覺剝奪性近視發(fā)展的關(guān)系.pdf

1、背景和目的 高度近視又稱病理性近視，是一種進(jìn)行性發(fā)展的眼病，隨著病程發(fā)展，眼軸延長，近視度數(shù)加深，并伴脈絡(luò)膜萎縮、視網(wǎng)膜變性及其它各種并發(fā)癥的發(fā)生，在世界各地占致盲眼病的第4～7位，因其對人類視力的嚴(yán)重危害性也使得近視的防治成為全球關(guān)注的熱點(diǎn)。對近視發(fā)病機(jī)制的研究己有200多年的歷史，人們也曾提出過許多假說，其中形覺剝奪學(xué)說認(rèn)為：影響視網(wǎng)膜上正常成像的因素可導(dǎo)致眼球異常生長，表現(xiàn)為眼軸過度增長，形成近視。1977年形覺剝奪性近視

2、(form-deprivation myopia，F(xiàn)DM)動(dòng)物模型被成功建立，從此高度近視的基礎(chǔ)研究取得了突破性的進(jìn)展。高度近視形成過程中，眼球后段發(fā)生病理性擴(kuò)張，同時(shí)伴隨視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的減少，而在許多神經(jīng)系統(tǒng)及視網(wǎng)膜變性疾病中神經(jīng)細(xì)胞的死亡是通過凋亡途徑實(shí)現(xiàn)的；此外，徐格致等也研究發(fā)現(xiàn)，人類高度近視眼視網(wǎng)膜中存在感光細(xì)胞凋亡的現(xiàn)象。 細(xì)胞凋亡(apoptosis)是機(jī)體在生理和病理過程中，由于內(nèi)、外環(huán)境變化或死亡信號觸發(fā)，在基

3、因調(diào)控下所引起的細(xì)胞主動(dòng)死亡過程。在眾多凋亡調(diào)控基因中Bcl-2基因蛋白家族成員如：Bcl-2、Bax、Bak、Bcl-xL等起著重要的作用，家族成員之間通過形成同/異源二聚體來發(fā)揮其生物學(xué)功能，調(diào)節(jié)細(xì)胞的死亡過程。本研究采用豚鼠FDM模型，模擬人類高度近視眼底改變，用TUNEL技術(shù)檢測視網(wǎng)膜細(xì)胞的凋亡，免疫組織化學(xué)法檢測Bak、Bcl-xL的表達(dá)水平，從而探討FDM的發(fā)病機(jī)制，Bak、Bcl-xL及細(xì)胞凋亡與FDM形成的關(guān)系。

4、 材料和方法 選用出生3天的健康花色豚鼠60只，實(shí)驗(yàn)前對豚鼠進(jìn)行散瞳檢影驗(yàn)光，排除先天性近視，用形覺剝奪的方法建立近視眼動(dòng)物模型。用半透明塑料眼罩遮蓋豚鼠右眼，分為A、B、C共3組，分別持續(xù)遮蓋4周、8周、12周，每組各20只；左眼開放作為正常對照組。兩組均采用視網(wǎng)膜檢影驗(yàn)光檢測屈光度；眼科A超測定活體眼軸長度；摘出眼球，剪除眼球周圍軟組織，固定、脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，4μm連續(xù)切片。常規(guī)HE染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察視網(wǎng)膜

5、及鞏膜形態(tài)學(xué)變化；采用TUNEL技術(shù)，檢測視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡情況。采用SP免疫組織化學(xué)技術(shù)，檢測視網(wǎng)膜Bak、Bcl-xL的表達(dá)水平。 結(jié)果 1．隨遮蓋時(shí)間的延長，豚鼠遮蓋眼的眼軸較對照眼明顯增長，負(fù)性屈光度顯著增加(P<0．05)。眼軸的增長與負(fù)性屈光度的增加之間存在著明顯的直線相關(guān)關(guān)系(r=0．855)。 2．B組、C組遮蓋眼后極部視網(wǎng)膜內(nèi)核層、外核層均可見散在的TUNEL染色陽性細(xì)胞，細(xì)胞核呈顆粒狀黃色或棕黃色

6、著色。B組、C組遮蓋眼視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡率分別為(0．27±0．14)％和(2．33±0．37)％，二者差異具有顯著性(P<0．05)。A組遮蓋眼及各組對照眼視網(wǎng)膜各層均未見凋亡細(xì)胞。 3．免疫組化結(jié)果顯示，Bak主要表達(dá)于感光細(xì)胞內(nèi)節(jié)、外核層及神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層，Bcl-xL主要表達(dá)于視網(wǎng)膜感光細(xì)胞層、內(nèi)核層及神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層，兩者的陽性細(xì)胞均表現(xiàn)為細(xì)胞漿呈棕黃色或黃色顆粒狀著色，但是Bcl-xL染色較Bak淺。C組遮蓋眼視網(wǎng)膜Bak平均灰

7、度值(113．48±7．77)與其對照眼(94．52±7．10)及B組遮蓋眼(97．26±7．23)相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．05)。Bcl-xL蛋白表達(dá)在兩組的遮蓋眼及對照眼之間均無明顯差異(P>0．05)。 4．B組、C組遮蓋眼視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡率與Bak蛋白表達(dá)強(qiáng)度的相關(guān)系數(shù)r值分別為0．79、0．88；與Bcl-xL蛋白表達(dá)強(qiáng)度的相關(guān)系數(shù)r值分別為．0．37、-0．31。 結(jié)論 1．本研究通過半透明眼罩

8、遮蓋的方法，成功復(fù)制了豚鼠FDM模型；隨遮蓋時(shí)間的延長眼軸增長，近視度數(shù)逐漸加深，遮蓋12周時(shí)可形成高度近視。 2．在豚鼠FDM形成過程中，眼底發(fā)生退行性改變，視網(wǎng)膜內(nèi)、外核層均可見散在的凋亡細(xì)胞出現(xiàn)，凋亡是FDM視網(wǎng)膜細(xì)胞死亡的機(jī)制之一。 3．FDM形成過程中視網(wǎng)膜可見Bak、Bcl-xL的表達(dá)。 4．視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡率與Bak的表達(dá)成明顯的正相關(guān)關(guān)系，與Bcl-xL表達(dá)無明顯相關(guān)性。Bak的高表達(dá)可能是促進(jìn)豚鼠