視網(wǎng)膜Sonic hedgehog信號通路在豚鼠形覺剝奪性近視眼模型中的作用機制研究.pdf

1、前言
　　 近視發(fā)病機制至今未完全明確，目前公認的近視發(fā)病機制之一是外界因素刺激了視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜中的某些調(diào)控因子，影響了轉(zhuǎn)化生長因子β(trans-forming growth factor-β，TGF-β)等生物活性物質(zhì)的平衡狀態(tài)，導致基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMP)活性增加，造成鞏膜組織松解、眼軸增長而產(chǎn)生近視。因此尋找確切的信號調(diào)控因子已成為近視發(fā)病機制研究的熱點。已有研究和我們的

2、前期實驗均提示Sonic hedgehog(Shh)可能作為一種視網(wǎng)膜重要信號因子參與了眼軸的生長導致近視形成。同時眼外研究中發(fā)現(xiàn)Shh信號通路可調(diào)控MMPs、TGF-β等活性因子的表達，亦提示上游視網(wǎng)膜Shh信號通路在近視發(fā)展過程中可能的下游通路。因此我們采用豚鼠的形覺剝奪性近視模型，通過外源性Shh-N玻璃體腔注射上調(diào)及特異性抑制劑cyclopamine抑制Shh表達，檢測Shh表達與TGF-β、MMP-2等生物活性因子改變的關(guān)系，

3、探索Shh信號因子對近視調(diào)控的作用和具體調(diào)控途徑，為近視眼防治提供依據(jù)。
　　 第一部分：豚鼠形覺剝奪性近視眼視網(wǎng)膜Shh信號通路和鞏膜MMP-2、TGF-β表達變化
　　 目的：在豚鼠形覺剝奪性近視模型(form-deprivation myopia，F(xiàn)DM)中檢測視網(wǎng)膜Shh及相關(guān)下游因子的表達變化，觀察鞏膜中MMF-2和TGF-β含量的改變。
　　 方法：56只2-3周齡三色健康豚鼠隨機分為FDM組(n=4

4、0)和空白對照組(control組)(n=16)。FDM組右眼眼周黏貼半透明薄膜，左眼及control組不作任何處理。FDM組和control組分別于形覺剝奪0周、1周、2周及4周取10只和4只豚鼠進行檢影驗光及眼軸長度等生物學測量后，處死取眼球行免疫熒光染色檢測視網(wǎng)膜Shh、受體Ptc-1以及核轉(zhuǎn)錄因子Gli-3表達水平，實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(real-time fluorescent quantitative revers

5、etranscription polymerase chain reaction，real-time PCR)檢測視網(wǎng)膜Shh、Ptc-1以及Gli-3mRNA水平變化，Western-blot檢測視網(wǎng)膜Shh蛋白表達水平及鞏膜組織中MMP-2、TGF-β的表達變化。
　　 結(jié)果：形覺剝奪1周、2周及4周后，F(xiàn)DM組遮蓋眼較對側(cè)眼分別誘導出-2.35±1.10D、-5.13±1.73D及-6.78±1.04D的相對近視，且隨著剝

6、奪時間的延長，近視程度加劇。形覺剝奪1周、2周及4周后，F(xiàn)DM組誘導出的相對眼軸分別延長0.1±0.05mm、0.11±0.04mm和0.37±0.19mm，差異均有統(tǒng)計學意義。形覺剝奪1周、2周及4周后，F(xiàn)DM組誘導出的相對玻璃體腔長度分別延長0.07±0.04mm、0.10±0.07mm和0.36±0.18mm，差異均有統(tǒng)計學意義。免疫熒光染色顯示，Shh彌漫表達于豚鼠視網(wǎng)膜各層；Ptc-1和Gli-3均表達于豚鼠視網(wǎng)膜的神經(jīng)節(jié)細胞

7、胞漿內(nèi)。形覺剝奪4周時，F(xiàn)DM組中遮蓋眼較對側(cè)眼ShhmRNA和Ptc-1mRNA表達水平明顯增加(P值分別為0.043和0.024)。Western結(jié)果顯示，形覺剝奪2周開始，遮蓋眼的Shh蛋白表達水平開始較左眼升高；遮蓋眼鞏膜MMP-2在剝奪2周后開始明顯升高，而TGF-β表達水平下降，并持續(xù)至4周。
　　 結(jié)論：在半透明薄膜法誘導的豚鼠FDM中，伴隨視網(wǎng)膜組織Shh及Ptc-1表達水平升高，以及鞏膜MMP-2表達上升和TG

8、F-β表達下降，提示Shh信號通路可能參與了豚鼠FDM的調(diào)控過程。
　　 第二部分：玻璃體腔內(nèi)注射Sonic hedgehog溶液對豚鼠近視發(fā)生發(fā)展的作用及相關(guān)機制研究
　　 目的：通過外源性玻璃體腔內(nèi)注射Shh溶液來觀察豚鼠近視發(fā)生發(fā)展及鞏膜組織中MMP-2、TGF-β表達水平的變化。
　　 方法：將出生2-3周齡三色健康豚鼠40只隨機分為2組，每組20只。每組的右眼進行Shh-N/0.1％牛血清蛋白(bovi

9、ne serum albumin，BSA)注射，左眼進行0.1％BSA注射。雙眼依次進行，隔2天注射一次，每次每只眼球注射10μl，共注射4次。兩組的Shh-N注藥濃度分別為20μg/ml(Shh20組)和50μg/ml(Shh50組)。在注藥的第14天(2周)進行驗光和眼軸等生物學測量后，處死取眼球行石蠟切片HE染色觀察視網(wǎng)膜形態(tài)變化，取鞏膜組織進行Western-Blot檢測MMP-2和TGF-β蛋白表達水平。結(jié)果與第一部分FDM組

10、2周(FDM2W)和Conrtrol組2周(Control2W)進行統(tǒng)計比較。
　　 結(jié)果：豚鼠玻璃體腔內(nèi)注射Shh-N20μg/ml及50μg/ml分別誘導豚鼠出現(xiàn)-1.54±0.75D和-4.04±1.48D的相對近視；0.11±0.09mm和0.14±0.03mm的相對眼軸延長；以及0.1±0.09mm和0.13±0.03mm的相對玻璃體腔長度延長：差異均有統(tǒng)計學意義。Shh50組較Shh20注藥組誘導出更深的相對近視度數(shù)

11、(P<0.001)及眼軸長度(P=0.0019)。Western-blot結(jié)果顯示，璃體腔內(nèi)注射Shh-N可使鞏膜組織MMP-2表達水平明顯上升，但Shh20組和Shh50組間表達未表現(xiàn)出明顯的差異；TGF-β表達水平未見明顯差異。
　　 結(jié)論：豚鼠玻璃體腔內(nèi)注射Shh-N可促進眼球向近視方向發(fā)展及眼軸延長，并且促進近視程度與注射的藥物呈一定濃度梯度；Shh-N注射后可導致鞏膜組織中MMP-2表達明顯上調(diào)，提示Shh信號通路通過

12、上調(diào)MMP-2表達水平，參與鞏膜重塑，眼軸增長，最終出現(xiàn)近視。
　　 第三部分：玻璃體腔內(nèi)注射Shh特異性抑制劑Cyclopamine對豚鼠形覺剝奪性近視發(fā)生發(fā)展的作用及相關(guān)機制研究
　　 目的：在FDM豚鼠玻璃體腔注射Cyclopamine以觀察其對近視發(fā)展抑制的作用，同時觀察下游鞏膜中MMP-2及TGF-β表達水平的變化，進一步探究Shh作用的下游鞏膜機制
　　 方法：將出生2-3周齡三色健康豚鼠60只隨機分

13、為3組，每組20只。每組的右眼進行半透明薄膜遮蓋，同時雙眼進行相同濃度cyclopamine注射。雙眼依次進行玻璃體腔內(nèi)注射，隔2天注射一次，每次每只眼球注射10μl，共注射4次。3組的cyclopamine注藥濃度分別為50μg/ml(FDM50組)、100μg/ml(FDM100組)及200μg/ml(FDM200組)。在注藥的第14天(2周)進行驗光和眼軸等生物學測量后，處死取眼球行石蠟切片HE染色觀察視網(wǎng)膜形態(tài)變化，取鞏膜組織進

14、行Western-Blot檢測MMP-2和TGF-β蛋白表達水平。結(jié)果與第一部分FDM組2周(FDM2W)和Conrtrol組2周(Control2W)進行統(tǒng)計比較。
　　 結(jié)果：FDM50組、FDM100組及FDM200組遮蓋眼較對側(cè)眼分別出現(xiàn)了-2.69±1.15D、-1.46±0.91D和-0.38±0.81D的相對近視；豚鼠玻璃體腔內(nèi)注射cyclopamine均能抑制豚鼠FDM的形成，F(xiàn)DM200組較FDM50組在程度上

15、更能抑制形覺剝奪性近視的形成(P<0.0001)。FDM50組、FDM100組及FDM200組遮蓋眼較對側(cè)眼分別出現(xiàn)了0.09±0.05mm、0.06±0.04mm和0.04±0.02mm的相對眼軸延長；FDM100組和FDM200組均抑制了部分形覺剝奪引起的相對眼軸延長(PFDM100=0.044，PFDM200=0.001)。FDM50組、FDM100組及FDM200組遮蓋眼較對側(cè)眼分別出現(xiàn)了0.09±0.05mm、0.07±0.0

16、5mm和0.04±0.05mm的相對玻璃體腔延長。FDM200組較FDM2W組和FDMSO組更能抑制部分形覺剝奪引起的相對玻璃體腔長度延長(P值分別為0.0446和0.0388)。鞏膜組織western-blot結(jié)果顯示，右眼的FDM2W組和FDM50組的MMP-2水平表達相當，均較對側(cè)眼明顯上調(diào)，但FDM100組和FDM200組的MMP-2水平較FDM2W組和FDM50組明顯下調(diào)。
　　 結(jié)論：玻璃體腔內(nèi)注射Shh特異性抑制劑