舒郁膠囊對大鼠海馬神經元5-HT3受體表達及其介導的Ca2+-CaM通路的作用.pdf

1、目的:觀察舒郁膠囊及其君藥柴胡的抗抑郁作用,通過離體實驗研究,結合血清藥理學實驗方法,以大鼠海馬神經元中5-HT3受體作為研究對象,初步探索抑郁情緒發(fā)病的微觀作用機制,并試圖明確調肝方藥舒郁膠囊的相應作用靶點。方法:運用無血清培養(yǎng)技術進行大鼠海馬神經元原代培養(yǎng);制備各組大鼠血清,在中藥血清藥理學的指導下,實驗共分為三個部分:1.采用孤養(yǎng)結合慢性溫和刺激復制抑郁情緒大鼠模型,以調肝方藥舒郁膠囊及其君藥柴胡的提取物進行藥物干預,氟西汀作為陽

2、性藥物對照,制備各組大鼠血清,分別加入體外培養(yǎng)新生大鼠海馬神經元的培養(yǎng)基中孵育24h,采用蛋白印跡技術(Western blot)和細胞免疫熒光技術(Immunofluorescence, IF)分別檢測神經元中5-HT3A受體和5-HT3B受體蛋白水平的表達。2.采用與實驗一相同的方法制備血清,在此基礎上運用熒光探針fluo-3/AM標記細胞內游離鈣離子,利用激光共聚焦顯微鏡觀察海馬神經元細胞內Ca2+熒光強度的變化及各組海馬神經元中

3、CaM受體蛋白水平表達量的變化,進一步研究舒郁膠囊及其君藥柴胡對5-HT3R-Ca2+-CaM通路的影響。3.制備一定濃度的舒郁膠囊和柴胡含藥血清,利用激動劑激活5-HT3受體信號通路,將5-HT3受體信號通路中的Ca2+-CaM體系單獨作為研究對象,觀察海馬神經元細胞內Ca2+熒光強度和CaM受體蛋白水平表達量的變化,探索舒郁膠囊及其君藥柴胡對5-HT3受體介導的Ca2+-CaM受體蛋白信號通路的作用。結果:1.Western blo

4、t和免疫熒光細胞化學實驗結果顯示,與正常組比較,抑郁情緒模型大鼠血清處理的神經元胞內5-HT3A受體和5-HT3B受體蛋白表達量均顯著性升高(P＜0.05);與模型組比較,用藥治療組血清處理的神經元5-HT3A受體表達量顯著性降低(P＜0.05),趨向于正常水平,舒郁膠囊治療組、柴胡治療組和氟西汀治療組之間無顯著性差異;但5-HT3B受體蛋白的表達量沒有顯著變化(P＞0.05)。2.實驗結果表明,與正常組相比,模型血清組海馬神經元內Ca

5、2+濃度明顯降低(P＜0.05),CaM蛋白表達水平也顯著性降低(P＜0.05);與模型血清組相比,藥物治療血清組海馬神經元細胞內Ca2+濃度較高,CaM蛋白表達水平亦顯著性升高(P＜0.05),與正常組無明顯差異(P＞0.05)。3.空白組大鼠海馬神經元鈣離子平均熒光強度為205.536,添加激動劑孵育15min后,激動劑組神經元細胞內鈣離子熒光強度和CaM蛋白水平表達明顯降低(P＜0.01)。事先給予舒郁膠囊和柴胡含藥血清干預24h

6、后,再次添加激動劑孵育,大鼠海馬神經元細胞內鈣熒光強度與空白組相比無明顯變化,較之激動劑組有顯著性升高(P＜0.05),神經元胞內CaM蛋白表達變化趨勢與Ca2+一致。結論:1.抑郁情緒模型大鼠血清處理的大鼠海馬神經元細胞內5-HT3A和5-HT3B受體蛋白表達量均顯著性升高,證實該受體與抑郁情緒的密切相關性。2.Westernblot和免疫熒光實驗結果顯示,調肝方藥舒郁膠囊及其君藥柴胡均可以有效糾正模型大鼠海馬神經元中5-HT3A受體

7、蛋白表達異常升高的狀態(tài),從而達到治療抑郁情緒的目的。3.舒郁膠囊不僅能調控5-HT3受體蛋白的表達,還可以顯著調節(jié)5-HT3受體相關的Ca2+-CaM受體蛋白的含量,其作用方式與5-HT3受體激動劑相反。4.將5-HT3受體信號通路中的Ca2+-CaM體系單獨研究發(fā)現,5-HT3受體激動劑激活信號通路后,使海馬神經元內大量鈣離子外流,并降低CaM蛋白表達,舒郁膠囊可調節(jié)神經元細胞內Ca2+達到動態(tài)平衡并增強CaM蛋白表達,推測舒郁膠囊通