ELP融合蛋白酶的應(yīng)用和SARS疫苗研發(fā)的研究.pdf

1、嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合征(severe acute respiratory syndrome，SARS)是由SARS冠狀病毒(SARS—CoV)引起的急性呼吸道傳染疾病。SARS—CoV是一種高致病性的病原體，導(dǎo)致較高的死亡率。盡管SARS疫情在2003年底基本被控制，但再次爆發(fā)SARS疫情的可能性仍然存在。快速診斷SARS及對人群進(jìn)行有效的疫苗接種對于早期病人的治療及防止傳染疾病的傳播都具有重要的意義。 Spike(S)蛋白和

2、nucleocapsid(N)蛋白是SARS—CoV兩個重要的結(jié)構(gòu)蛋白。SARS—CoV病毒的受體結(jié)合區(qū)(receptor binding domain RBD)位于S蛋白的N端，能誘導(dǎo)機體免度系統(tǒng)產(chǎn)生對抗病毒的中和抗體；N蛋白是病毒早期感染細(xì)胞后主要表達(dá)的病毒蛋白之一，能誘導(dǎo)產(chǎn)生體液免疫與細(xì)胞免疫?？焖俦磉_(dá)純化這些抗原作為抗病毒疫苗和檢測SARS病人血樣的抗體，對于防止可能曝發(fā)SARS疫情具有重要意義。 應(yīng)用彈性蛋白樣多肽(e

3、lastin like polypeptide，ELP)標(biāo)簽，可以在無需層析方法協(xié)助下，通過可逆轉(zhuǎn)變循環(huán)(inverse transition cycling，ITC)純化ELP融合蛋白?？梢酝葡?，利用ELP融合蛋白酶可以對ELP融合蛋白進(jìn)行切割，并通過ITC去除ELP和ELP融合蛋白酶，從而高效地純化獲得無標(biāo)簽的目的蛋白，整個過程不需要層析的分離方法。應(yīng)用這個技術(shù)可以高效純化病毒抗原，為疫苗研發(fā)提供基礎(chǔ)。 本論文的主要研究內(nèi)容

4、如下： (1)為了快速表達(dá)和純化病毒抗原，我們建立了一個無需層析技術(shù)協(xié)助的高效純化蛋白的技術(shù)平臺：應(yīng)用ELP標(biāo)簽對蛋白進(jìn)行純化，并應(yīng)用ELP—3C蛋白酶對ELP融合蛋白進(jìn)行切割，通過ITC除去ELP和ELP—3C蛋白酶而獲得無標(biāo)簽的目的蛋白。為了驗證方法的可行性，應(yīng)用這個方法對谷胱甘肽—S—轉(zhuǎn)移酶(glutatione S—transferase，GST)，綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP

5、)，麥芽糖結(jié)合蛋白(maltose binding protein，MBP)，和硫氧還蛋白(thioredoxin，TRX)進(jìn)行純化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)可以實現(xiàn)不需要在層析方法的協(xié)助下純化這些蛋白，而且純化的蛋白保持活性。同時也發(fā)現(xiàn)，ELP—3C蛋白酶能夠連續(xù)進(jìn)行多次酶切，仍然保持酶切活性。為了進(jìn)一步驗證這個方法的可行性和通用性，純化了ELP—SUMO(small ubiquitin—related modifier，SUMO)蛋白酶和ELP—S

6、UMO—GFP融合蛋白，發(fā)現(xiàn)ELP—SUMO蛋白酶能有效地切割害ELP—SUMO—GFP，并可通過ITC除去ELP—SUMO和ELP—SUMO蛋白酶，進(jìn)而純化了GFP。所以ELP—3C蛋白酶和ELP—SUMO蛋白酶都可以在無需層析分離技術(shù)下純化目的蛋白。 (2)應(yīng)用以上建立的無需層析技術(shù)協(xié)助的高效純化蛋白的技術(shù)平臺，快速表達(dá)純化了N蛋白和N的片段蛋白N2并應(yīng)用于檢測病人血清中的抗體。Western blotting結(jié)果發(fā)現(xiàn)：純化

7、的N蛋白可以被SARS康復(fù)病人的血清所識別，但不被健康人的血清識別。另外，對病人的血清進(jìn)行1000倍稀釋后仍然可以檢測到N2蛋白，說明SARS—CoV N蛋白具有很強的免疫原性。同時我們也利用金屬螯合親和層析技術(shù)純化了在畢赤酵母中表達(dá)的N蛋白，并對表達(dá)N蛋白的酵母進(jìn)行高密度發(fā)酵，檢測了蛋白的表達(dá)情況。 (3)含有病毒受體結(jié)合區(qū)的S片段蛋白S1，能夠誘導(dǎo)針對SARS—CoV的保護(hù)性的中和抗體，可以作為一種高效的疫苗。我們嘗試應(yīng)用不

8、同的表達(dá)系統(tǒng)對其進(jìn)行表達(dá)與純化。前面的工作發(fā)現(xiàn)，在大腸桿菌中表達(dá)S1蛋白為包涵體。為了獲得可溶性的S1蛋白，我們在畢赤酵母中分泌表達(dá)了S1蛋白。采用免疫斑點雜交技術(shù)快速的鑒定出表達(dá)S1蛋白的酵母。將陽性克隆進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，Western blotting結(jié)果發(fā)現(xiàn)S1蛋白被過度糖基化。為了獲得無糖基化的S1蛋白，改用胞內(nèi)表達(dá)S1。發(fā)現(xiàn)通過共表達(dá)蛋白二硫鍵異構(gòu)酶(Protein disulfide isomerase，PDI)可以提高S1蛋白

9、的可溶性。另外對表達(dá)s1蛋白的酵母進(jìn)行高密度的發(fā)酵，并檢測蛋白的表達(dá)情況。 (4)病毒樣顆粒(virus like particle，VLP)不含有病毒的基因組，能誘導(dǎo)體液免疫與細(xì)胞免疫反應(yīng)，是一種高效的疫苗。我們嘗試在酵母和哺乳動物細(xì)胞中組裝SARS—CoV的VLP。在酵母中，發(fā)現(xiàn)只有E蛋白能表達(dá)，而M蛋白不表達(dá)。在哺乳動物細(xì)胞中，利用腺病毒攜帶M和E基因進(jìn)行共感染細(xì)胞而組裝病毒的VLP，但發(fā)現(xiàn)只有攜帶M基因的重組腺病毒制備成

10、功，而攜帶E基因的腺病毒制備不成功?？赡苁荅蛋白對包裝細(xì)胞產(chǎn)生毒性而導(dǎo)致病毒制備失敗。 總之，在本研究中，我們建立了一個無需層析技術(shù)協(xié)助的快速純化蛋白的技術(shù)平臺，并應(yīng)用于純化病毒抗原，為抗病毒疫苗和SARS診斷試劑的研發(fā)提供了基礎(chǔ)。同時N蛋白和含有RBD的S1蛋白在酵母中成功表達(dá)，我們也對SARS—CoV病毒樣顆粒(Virus like particle，VLP)在酵母和哺乳動物細(xì)胞的組裝進(jìn)行了初步研究，為今后進(jìn)一步開展研究工作