紫杉烷類化合物生物轉(zhuǎn)化及手性藥物左旋3—丁基苯酞生物合成的研究.pdf

1、本論文主要進(jìn)行的是生物轉(zhuǎn)化方面的研究，包括兩部分的內(nèi)容：紫杉烷類化合物的生物轉(zhuǎn)化和手性藥物左旋3-丁基苯酞的生物合成。 在紫杉烷類化合物的生物轉(zhuǎn)化研究中，主要進(jìn)行了以下研究： 1.紫杉烷類化合物SinenxanA的生物轉(zhuǎn)化：通過對SinenxanA進(jìn)行有效生物轉(zhuǎn)化的微生物菌種篩選，發(fā)現(xiàn)木賊鐮孢菌對SinenxanA有很好的生物轉(zhuǎn)化能力，進(jìn)而對其進(jìn)行搖瓶放大實驗，通過乙酸乙酯提取，硅膠柱層析，分離得到一個已知的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物：1

2、0β-hydroxy-2a，5a，14β-triacetoxy-4(20)，11-taxadiene，即10-deacetylsinenxanA，收率為17％。 2.銀杏細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系對14-去乙酰氧基sinenxanA的生物轉(zhuǎn)化：在轉(zhuǎn)化中得到兩個轉(zhuǎn)化產(chǎn)物：10β-hydroxy-2a,5a-diacetoxy-4(20)，11-taxadiene(Ⅰ)和10β-butyloxy-2a,5a-diacetoxy-4(20),1

3、1-taxadiene(Ⅱ)，收率均約為19％，這兩個化合物均為新化合物，并對底物14-去乙酰氧基sinenxanA和化合物Ⅰ、Ⅱ進(jìn)行了細(xì)胞毒活性評價，發(fā)現(xiàn)底物無論對腫瘤細(xì)胞(KB、MCF-7)還是對腫瘤多藥耐藥性細(xì)胞(KB/VCR、MCF-7/ADR)均具有較好的細(xì)胞毒活性，而化合物Ⅰ和Ⅱ的細(xì)胞毒活性均不如底物的強(qiáng)。 在手性藥物左旋3-丁基苯酞的生物合成研究中，主要進(jìn)行了以下研究： 1.川芎愈傷組織、細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系的

4、建立及其化學(xué)成分氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析：誘導(dǎo)并建立了川芎愈傷組織、細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系。愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+1.0mg/L2,4-D+0.5mg/LCTK，繼代培養(yǎng)基為MS+1.0mg/L2,4-D，培養(yǎng)條件為25℃，黑暗培養(yǎng)，35天左右傳代一次，接種量約5g(鮮重)愈傷組織。誘導(dǎo)懸浮培養(yǎng)的培養(yǎng)基為MS+1.0mg/L2,4-D，由傳代一年的愈傷組織誘導(dǎo)得到，培養(yǎng)條件為轉(zhuǎn)速130rpm，25℃黑暗培養(yǎng)，每隔16天傳代一次。通過氣相色譜

5、-質(zhì)譜聯(lián)用分析，發(fā)現(xiàn)愈傷組織和細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物成分相似，但與原植物的成分區(qū)別很大，它們也幾乎不含有原植物中的主要活性成分3-丁基苯酞和新蛇床內(nèi)酯。這表明愈傷組織和細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物的生化特性不同于原植物。 2.化學(xué)合成并得到了3-丁烯基苯酞(收率59％)、鄰戊?；郊姿徕c(收率98％)與鄰戊酰基苯甲酸、2-(α-羥基戊基)苯甲酸鈉(收率98％)。 3.2-(α-羥基戊基)苯甲酸鈉與3-丁基苯酞的互變與pH值之間的關(guān)系：隨著pH

6、值的降低，2-(α-羥基戊基)苯甲酸鈉的量逐漸減少，3-丁基苯酞的量逐漸增加。在pH值3.13之前，2-(α-羥基戊基)苯甲酸鈉的量減少較慢，3-丁基苯酞的量增加也較少；pH值3.13之后，二者的量變化很快；到pH值1.88～1.51之間，二者的量幾乎沒有變化，二者之間的互變達(dá)到一個穩(wěn)定的平衡，2-(α-羥基戊基)苯甲酸鈉約占4％，3-丁基苯酞約占93％。這一結(jié)果表明，2-(α-羥基戊基)苯甲酸鈉自動環(huán)化生成3-丁基苯酞的最適pH值范圍

7、為：pH值1.88～1.51，此時2-(α-羥基戊基)苯甲酸鈉約占4％，3-丁基苯酞約占93％。 4.3-丁基苯酞氣相色譜分析方法的建立：3-丁基苯酞氣相色譜分析的線性回歸方程為：A=17576c+0.84，r=0.9999，線性范圍為0.0632～0.632mg/mL。5.對3-丁基苯酞進(jìn)行有效生物合成的微生物菌種篩選：通過從不同的土壤中共分離出191株菌株，分別對它們進(jìn)行了生物合成3-丁基苯酞的篩選，用TLC以及HPLC進(jìn)行

8、檢測，發(fā)現(xiàn)黑曲霉以鄰戊?；郊姿徕c為底物生物合成3-丁基苯酞的效果最好。 6.黑曲霉生物合成左旋3-丁基苯酞的放大試驗：黑曲霉對底物鄰戊?；郊姿徕c的生物轉(zhuǎn)化合成了3-丁基苯酞，并且為左旋3-丁基苯酞，其ee值為95％，對映體選擇性較高，產(chǎn)物光學(xué)活性較高。 7.黑曲霉生物合成左旋3-丁基苯酞的生理特性及影響因素：發(fā)酵液中pH值的變化情況是在加入底物后轉(zhuǎn)化的前三天，發(fā)酵液的pH值較穩(wěn)定，幾乎沒有改變；在轉(zhuǎn)化的第四天，pH值

9、出現(xiàn)較大的增高；在隨后的幾天轉(zhuǎn)化時間中，pH值趨于平穩(wěn)，改變的范圍很小。黑曲霉菌的生長情況是：在培養(yǎng)的前兩天，生物量的增長較慢，為延滯期；在培養(yǎng)的第三天，生物量突然出現(xiàn)很大的增長，為對數(shù)期；在培養(yǎng)的第四天，生物量又迅速減少，為衰亡期；隨后的幾天培養(yǎng)中，生物量依然繼續(xù)減少，表明菌絲在不斷自溶。Tween80在黑曲霉對底物鄰戊酰基苯甲酸鈉進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化合成左旋3-丁基苯酞中有很大的影響，起明顯的促進(jìn)作用。當(dāng)加入Tween80時，黑曲霉合成左旋