冠脈轉(zhuǎn)染Nrf2基因?qū)Υ笫笕毖俟嘧⑿募〉谋Ｗo(hù)作用及機(jī)制的研究.pdf

1、目的：(1).構(gòu)建攜帶人Nrf2基因的腺病毒載體；(2).研究冠脈途徑腺病毒載體轉(zhuǎn)染Nrf2基因到心肌的可行性，如果可行觀察其對缺血再灌注心肌的影響；(3).研究Nrf2基因保護(hù)缺血再灌注心肌的可能機(jī)制。
　　 方法：(1).構(gòu)建包含Nrf2的重組腺病毒：采用分子克隆手段獲得攜帶增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)基因的重組質(zhì)粒、攜帶Nrf2的重組質(zhì)粒，以細(xì)胞內(nèi)同源重組法構(gòu)建重組腺病毒Adv-EGFP、Adv-Nrf2，在293細(xì)胞內(nèi)

2、分別擴(kuò)增，按Adeno-XTM Virus Purification Kit(BDBiosciences，Clontech)的步驟純化病毒。經(jīng)純化的病毒滴度分別為，Adv-EGFP：1×1012(PFU/mL)、Adv-Nrf2:1×1012(PFU/mL)。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定實(shí)驗(yàn)使用最佳Adv-EGFP、Adv-Nrf2滴度為1×109(PFU/ml)，用量為0.1ml。
　　 (2).40只SD大鼠隨機(jī)分成4組(n=10)

3、。大鼠左側(cè)開胸，暴露心尖部及主、肺動(dòng)脈根部，用10號線于主、肺動(dòng)脈根部阻斷循環(huán)，同時(shí)用27號針頭于心尖部注入0.1ml各組相應(yīng)試劑至左心室腔，使之在密閉的冠脈循環(huán)內(nèi)分布，10秒后松開10號線。其中第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組注射0.1ml空病毒載體；第Ⅳ注射0.1ml含Adv-Nrf2的重組腺病毒。關(guān)胸蘇醒后，穩(wěn)定3天，使經(jīng)冠脈轉(zhuǎn)染的基因充分表達(dá)于心肌。
　　 (3).冠脈轉(zhuǎn)染3天后，再次暴露胸腔，在左心耳與肺動(dòng)脈圓錐之間結(jié)扎心大靜脈及冠狀動(dòng)

4、脈左前降支(LAD)。結(jié)扎30min后，松開縫線使冠狀動(dòng)脈再通120min。Ⅰ組只穿線不結(jié)扎。Ⅲ組在LAD結(jié)扎5min后開放5min，并重復(fù)3次，然后再行30min缺血、120min再灌注。
　　 (4).采用BL-420F系統(tǒng)全程監(jiān)測所有動(dòng)物心電活動(dòng)及平均動(dòng)脈壓；采用Evan’s Blue和TTC雙染色法測定心肌梗死面積；光學(xué)顯微鏡下觀察心肌的炎癥改變；電鏡下觀察心肌超微結(jié)構(gòu)的改變；硫代巴比妥酸法測定心肌組織MDA的含量；黃嘿

5、吟氧化酶原理測定心肌組織SOD活性；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測定心肌組織TNF-a的含量；Western Blotting免疫印跡測定Bcl-2及Bax蛋白表達(dá)的改變；原位末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測心肌細(xì)胞凋亡等。
　　 結(jié)果：(1).HR、MAP、心律失常及心肌梗死面積的觀察：各組大鼠HR、MAP在基礎(chǔ)狀態(tài)時(shí)無明顯差異；缺血再灌注后后，HR在T3、T5、T6時(shí)下降較明顯(P<0.05)；MAP則在T1、13、T4、T5、T6時(shí)下降較

6、明顯(P<0.05)；各組心律失常發(fā)生率均明顯增高(P<0.05)；而Ⅲ組、Ⅳ組腿、MAP及心律失常發(fā)生率明顯好于Ⅱ組。Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組心肌梗死面積分別為(37.6±1.9)％、(26±1.5)％、(26.6±1.0)％。與Ⅱ組比較，Ⅲ、Ⅳ組能明顯的降低心肌梗死面積(P<0.05)。
　　 (2).心肌酶學(xué)與肌鈣蛋白的觀察：I/R后，各組LDH、CK、CK-MB、cTnI均明顯升高(P<0.05)，Ⅲ、Ⅳ組與Ⅱ組比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<

7、0.05)；Ⅳ組CK、CK-MB比Ⅲ組升高更為明顯(P<0.05)。
　　 (3).光鏡及電鏡觀察：光鏡下Ⅱ組呈現(xiàn)心肌損傷病理改變，可見細(xì)胞水腫、排列紊亂、心肌纖維斷裂、大量紅細(xì)胞及中性粒細(xì)胞浸潤等；而Ⅲ、Ⅳ組病理損傷程度較Ⅱ組明顯減輕。電鏡下Ⅱ組損傷最嚴(yán)重，可見心肌水腫明顯，心肌纖維排列紊亂，部分有斷裂和溶解，明暗帶不清，線粒體腫脹，部分嵴斷裂溶解，并有廣泛空泡樣變性等，而Ⅲ、Ⅳ組亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷較Ⅱ組明顯減輕。
　　

8、(4).氧化損傷程度及炎性細(xì)胞因子的觀察：I/R后，各組MDA、TNF-a均明顯升高(P<0.05)，Ⅲ、Ⅳ組與Ⅱ組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。缺血再灌注后，各組SOD明顯降低(P<0.05)，Ⅲ、Ⅳ組與Ⅱ組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 (5).心肌表達(dá)的蛋白及細(xì)胞凋亡的觀察：缺血再灌注后，各組Bcl-2/Bax比值均明顯降低(P<0.05)，Ⅲ、Ⅳ組與Ⅱ組比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。I/R后，各組大鼠心肌

9、細(xì)胞凋亡均明顯增多(P<0.05)，Ⅲ、Ⅳ組與Ⅱ組比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 結(jié)論：(1).成功構(gòu)建了Adv-EGFP和Adv-Nrf2，為進(jìn)一步研究其功能奠定了基礎(chǔ)；
　　 (2).Nrf2基因能通過冠脈途徑轉(zhuǎn)染至大鼠心肌，過表達(dá)Nrf2基因?qū)θ毖俟嘧⑿募【哂忻黠@的保護(hù)作用；
　　 (3).過表達(dá)Nrf2通過激活Nrf2-Keapl-ARE信號通路，通過增強(qiáng)抗氧化應(yīng)激、抗炎及抑制心肌細(xì)胞凋亡保護(hù)缺