大孔吸附樹脂吸附分離家蠅抗菌肽的研究.pdf

1、昆蟲抗菌肽是昆蟲免疫防御系統(tǒng)的重要成分，具有相對(duì)分子質(zhì)量小、熱穩(wěn)定性好、抗菌譜廣等特點(diǎn)。家蠅存在獨(dú)特的免疫機(jī)制，在我國分布廣，資源豐富，容易養(yǎng)殖、成本低，是一個(gè)等待開發(fā)的良好資源。因此對(duì)家蠅抗菌肽分離純化的研究具有重要理論意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。 家蠅抗菌肽的抑菌活性與其疏水性有一定的聯(lián)系，故采用大孔吸附樹脂根據(jù)疏水性的差異來從家蠅粗蛋白中分離家蠅抗菌肽，并對(duì)大孔吸附樹脂的分離工藝進(jìn)行了優(yōu)化選擇，然后通過RP-HPLC進(jìn)一步純化，得

2、到了抑菌活性最高的組分。 本論文考察多種大孔吸附樹脂對(duì)家蠅蛋白的吸附性能，D101大孔吸附樹脂對(duì)家蠅蛋白的吸附量可達(dá)217.18mg/g，乙醇是比較理想的洗脫劑，隨著乙醇的濃度增加，洗脫率也相應(yīng)提高，當(dāng)用75％乙醇洗脫時(shí)，洗脫率為75.70％。通過試驗(yàn)確定D101大孔吸附樹脂富集分離家蠅抗菌肽的上樣條件為：上樣流速0.5BV/h(BV，BedVolume，床體積)，上樣濃度為15mg/mL。D101大孔吸附樹脂富集分離洗脫采用1

3、5％、35％和55％的乙醇分級(jí)洗脫，經(jīng)過這三種濃度的乙醇溶液洗脫后得到的組分的蛋白質(zhì)含量分別為39.40％、71.72％和72.74％，而粗家蠅蛋白的蛋白質(zhì)含量只有12.79％，說明洗脫后的蛋白質(zhì)的含量有很大的提高，同時(shí)其疏水性值也從粗家蠅蛋白的4.17kJ/mol分別增加到了4.30KJ/mol、4.43kJ/mol和4.75kJ/mol。隨著疏水性的提高，家蠅抗菌肽的抑菌活性也呈現(xiàn)增加的趨勢，其中55％乙醇洗脫組分的抑菌活性最高。

4、 經(jīng)過分離純化使用后的樹脂再吸附性能降低，用常規(guī)的再生方法不能恢復(fù)大孔吸附樹脂的吸附能力，研究分別采用酸醇法和堿醇法對(duì)D101大孔吸附樹脂再生條件進(jìn)行優(yōu)化：酸醇法對(duì)D101大孔吸附樹脂的靜態(tài)再生條件為HCl濃度0.1mol/L，乙醇濃度85％，溫度30℃，浸泡時(shí)間6h，再生液用量50mL/g干樹脂；動(dòng)態(tài)再生條件為再生液流速1BV/h，再生液用量66.7mL/g，其他條件同靜態(tài)再生。堿醇法對(duì)D101大孔吸附樹脂的靜態(tài)再生條件為NaO

5、H濃度0.1mol/L，乙醇濃度85％，溫度為30℃，浸泡時(shí)間6h，再生液用量66.7mL/g干樹脂；動(dòng)態(tài)再生條件為再生液流速為1BV/h，其他條件同靜態(tài)再生。在上述條件下，同時(shí)使用酸醇法和堿醇法對(duì)D101大孔吸附樹脂進(jìn)行再生，使用20次后樹脂的吸附性能僅降低1.5％。 對(duì)D101大孔吸附樹脂富集分離的55％乙醇洗脫組分進(jìn)一步進(jìn)行RP-HPLC純化，得到的多個(gè)峰都具有抑菌活性，其中F12的抑菌活性最高。經(jīng)過二次RP-HPLC和S

6、DS-PAGE電泳檢測，該峰達(dá)到色譜純和電泳純，測得其相對(duì)分子質(zhì)量為4842。氨基酸分析表明，F(xiàn)12富含堿性氨基酸和疏水性氨基酸，疏水性值為5.82kJ/mol。與D101大孔吸附樹脂分離組分相比，F(xiàn)12的疏水性增加更為明顯，其抑菌活性也有大幅度的提高。測定各種組分對(duì)各試驗(yàn)菌的MIC(MinimalInhibitoryConcentration，最低抑菌濃度)可以知F12對(duì)大腸桿菌的MIC最低，為30μg/mL。同時(shí)，試驗(yàn)證明F12具有