采用新一代測(cè)序技術(shù)分析不同感染階段乙型肝炎病毒準(zhǔn)種異質(zhì)性及其臨床意義.pdf

1、背景與目的：
　　本課題組之前采用克隆測(cè)序(CBS)的方法研究發(fā)現(xiàn)乙型肝炎病毒(HBV)逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)（RT區(qū)）準(zhǔn)種異質(zhì)性可作為接受核苷類似物治療患者抗病毒療效的一個(gè)預(yù)測(cè)指標(biāo)。近年來，第二代測(cè)序技術(shù)(NGS)以其相對(duì)快速、超深度、高靈敏度的特點(diǎn)給HBV準(zhǔn)種研究帶來了新的策略。目前對(duì)于HBV感染后不同臨床階段的病毒全長(zhǎng)準(zhǔn)種異質(zhì)性的研究還未見報(bào)道。本研究應(yīng)用CBS及NGS方法擴(kuò)增并獲得急性乙型肝炎（AHB）、慢性HBV攜帶(IT)、慢性乙

2、型肝炎(CHB)、慢加急性乙型肝炎伴肝衰竭(ACLF)、代償期肝硬化(LC)患者血清病毒全長(zhǎng)序列，結(jié)合生物信息學(xué)分析方法描述準(zhǔn)種遺傳異質(zhì)性特征及探討其臨床意義，以期更好的闡述HBV自然史及致病機(jī)制。
　　研究對(duì)象與方法：
　　本研究共納入97名HBV感染的患者（AHB、IT、CHB、ACLF、LC）。40例應(yīng)用CBS方法、87例應(yīng)用NGS方法（30例同時(shí)應(yīng)用兩種方法）獲得HBV全長(zhǎng)基因組的準(zhǔn)種后，通過生物信息學(xué)方法對(duì)準(zhǔn)種的異

3、質(zhì)性（復(fù)雜度和離散度）特征進(jìn)行分析，并建立了NGS大數(shù)據(jù)初篩流程和質(zhì)控方法，最后分析五種不同感染階段的病毒準(zhǔn)種異質(zhì)性、氨基酸突變指數(shù)、單個(gè)核苷酸復(fù)雜度、CP/PreC核苷酸突變率的特點(diǎn)及其與臨床病程演變的相關(guān)性。
　　結(jié)果：
　　第一部分:40例HBV感染患者，采用CBS方法，平均每名患者獲得14-17株HBV全長(zhǎng)克隆，急性HBV感染的準(zhǔn)種復(fù)雜度較慢性HBV感染的準(zhǔn)種復(fù)雜度低;慢性HBV感染免疫耐受期準(zhǔn)種復(fù)雜度低于免疫清除期

4、;不同的免疫壓力下Core區(qū)aa60-130及X區(qū)aa131-135氨基酸變異指數(shù)(MFI)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，ACLF在這些區(qū)域氨基酸突變指數(shù)大于IT及AHB，CHB次之。高突變位點(diǎn)集中在Core區(qū)T、B細(xì)胞表位。
　　第二部分:87例HBV感染患者，采用Illumina Miseq高通量測(cè)序獲得30G數(shù)據(jù)，經(jīng)過數(shù)據(jù)初篩獲得可分析數(shù)據(jù)20G，約12000000條序列進(jìn)入最終分析階段。在建立高通量測(cè)序的大數(shù)據(jù)篩選流程的基礎(chǔ)上，對(duì)于高通量

5、數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選（步驟包括:測(cè)序質(zhì)量、測(cè)序長(zhǎng)度、序列比對(duì)優(yōu)化、PCR錯(cuò)誤糾正優(yōu)化、內(nèi)參質(zhì)控評(píng)價(jià)）和生物信息學(xué)分析，每個(gè)區(qū)段豐度（除P3外）中位數(shù)為6000(1500-20000)。在五種不同感染階段中，IT的復(fù)雜度(Sn)和平均遺傳距離(d)最低，其次為CHB和AHB，ACLF與LC的Sn和d最高。準(zhǔn)種的Sn和d在CHB患者中與高谷丙轉(zhuǎn)氨酶(＞5×ULN)、與總膽紅素(＞1×ULN)血癥、與ACLF預(yù)后無關(guān)。BCP/PreC區(qū)核苷酸的分析發(fā)

6、現(xiàn):ACLF和LC患者在CP區(qū)A1762T、G1764A、A1846T/C的變異率達(dá)到50％-90％，高于其他組(P＜0.001)。T1800C在感染B基因型的ACLF患者中變異率最高達(dá)46％，而在C基因型中僅有2.4％。未經(jīng)核苷類似物治療的患者病毒準(zhǔn)種耐藥位點(diǎn)突變率在LC組高于其他組(1-4％ vs.＜1％)。CBS與NGS的Sn和d相關(guān)性和一致性較差(P＞0.05)。
　　綜合上述結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AHB準(zhǔn)種異質(zhì)性在CBS研究中為最低

7、，但是在NGS研究中高于IT及CHB準(zhǔn)種異質(zhì)性。慢性感染患者的HBV準(zhǔn)種復(fù)雜度與免疫壓力和感染時(shí)間有關(guān)，即免疫壓力越大(ACLF)，感染時(shí)間越長(zhǎng)(LC)，復(fù)雜度越高，B細(xì)胞表位對(duì)應(yīng)的氨基酸突變率(HBcAg)越高。IT患者三年的HBV準(zhǔn)種變化的主要發(fā)生在HBsAg/RT區(qū)域，表現(xiàn)為突變的積累。
　　結(jié)論：
　　本研究建立了Illumina Miseq高通量測(cè)序研究HBV準(zhǔn)種的大數(shù)據(jù)篩選流程和質(zhì)控分析方法，發(fā)現(xiàn)在低豐度變異的檢