血紅素加氧酶-一氧化碳系統(tǒng)在復(fù)發(fā)緩解型實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎中的作用及機(jī)制.pdf

1、目的：多發(fā)性硬化（multiple sclerosis，MS）是一種以中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）白質(zhì)脫髓鞘為主要病理特點(diǎn)的自身免疫性疾病。其確切病因及發(fā)病機(jī)制目前尚未闡明，較公認(rèn)的觀點(diǎn)認(rèn)為MS與環(huán)境、遺傳、感染因素有關(guān)。因此通過(guò)建立動(dòng)物模型，探討MS的發(fā)病機(jī)制，尋求有效的治療方案，是目前研究的主要方向。
　　 越來(lái)越多的證據(jù)表明，氧化應(yīng)激在MS的動(dòng)物模型.實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（exp

2、erimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）的中起重要作用。氧化應(yīng)激是多種不同疾病發(fā)病的根本機(jī)制，與許多神經(jīng)疾病有關(guān)。氧化損傷在EAE中非常重要，因?yàn)橹袠猩窠?jīng)系統(tǒng)，尤其是少突膠質(zhì)細(xì)胞，對(duì)氧化損傷非常敏感。機(jī)體中存在大量的內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)以對(duì)抗氧化應(yīng)激損傷。血紅素加氧酶（heme oxygenase，HO）就是其中之一。HO-1是一種氧化應(yīng)激誘導(dǎo)下的熱休克蛋白，可以催化血紅素分解生成一氧化碳（ca

3、rbon monoxide，CO）和抗氧化劑膽綠素，后者是多種疾病情況下抗自由基的主要防御機(jī)制。HO-1可以被熱休克和氧化應(yīng)激等多種刺激因素誘導(dǎo)，在多種病理?xiàng)l件下發(fā)揮其抗自由基的內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，如炎癥、缺血性發(fā)作和多種神經(jīng)變性疾病。但是，只有很少的研究報(bào)道過(guò)HO-1在EAE中的表達(dá)，而且其在EAE中的作用也不清楚。
　　 本實(shí)驗(yàn)旨在檢測(cè)HO-1在EAE中的誘導(dǎo)表達(dá)，探討HO-1/CO系統(tǒng)在EAE發(fā)病中的影響。通過(guò)抗氧化劑-硫辛酸

4、和血紅素氧合酶抑制劑-錫原卟啉對(duì)EAE大鼠的干預(yù)來(lái)觀察其對(duì)脫髓鞘疾病的治療作用，同時(shí)通過(guò)基因芯片技術(shù)檢測(cè)與發(fā)病相關(guān)的基因。
　　 方法：
　　 1.動(dòng)物分組：將100只成年健康雌性Wistar大鼠，體重180～200 g，隨機(jī)分出正常對(duì)照組6只，其余動(dòng)物用新鮮豚鼠全脊髓勻漿（GPSCH）誘導(dǎo)免疫，待動(dòng)物第一次發(fā)病后隨機(jī)選出發(fā)病組大鼠6只，其余平均分為EAE組、地塞米松組（DXM組，2 mg·kg-1·d-1）、硫辛酸組（

5、LA組，100 mg·kg-1·d-1）、錫原卟啉組（SNPP組，loo μ mol·kg-1·d-1）。其中EAE和各藥物干預(yù)組再按病程分為緩解、復(fù)發(fā)兩個(gè)亞組，每亞組6只（藥物干預(yù)組動(dòng)物無(wú)復(fù)發(fā)者，按預(yù)實(shí)驗(yàn)中統(tǒng)計(jì)的EAE組動(dòng)物緩解復(fù)發(fā)平均天數(shù)分為干預(yù)后7天組和干預(yù)后14天組）。
　　 2.模型制備：將新鮮豚鼠全脊髓制成勻漿，加上完全福氏佐劑（complete Freund's adjuvant，CFA），佐劑中所含卡介苗6mg/

6、ml，經(jīng)過(guò)乳化后按0.5 ml/只分別于大鼠四肢足墊和背部皮下注射。藥物治療組于動(dòng)物發(fā)病后（神經(jīng)功能評(píng)分達(dá)2分）第一天起給予相應(yīng)劑量腹腔注射，連續(xù)注射7天。
　　 3.神經(jīng)功能評(píng)分：于免疫誘導(dǎo)當(dāng)日及免疫后每天對(duì)動(dòng)物的體重變化、精神狀態(tài)、活動(dòng)情況進(jìn)行觀察，并對(duì)動(dòng)物進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，采用國(guó)際通用的Kono評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，分為5分：0分正常；1 分動(dòng)物尾部無(wú)力；2 分尾部無(wú)力+肢體無(wú)力；3 分肢體輕度麻痹；4 分肢體嚴(yán)重麻痹，被動(dòng)翻身后不能

7、復(fù)原；5.分瀕死狀態(tài)或死亡。
　　 4.組織病理學(xué)：在動(dòng)物麻醉狀態(tài)下，快速取其脊髓中腰膨大處組織，4％多聚甲醛固定，石蠟包埋，組織切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況。
　　 5.免疫組織化學(xué)染色：取動(dòng)物脊髓腰膨大處組織，石蠟包埋，做6 μ m橫截面切片，血清封閉，加HO-1一抗，經(jīng)二抗、三抗孵育，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水透明，中性樹(shù)膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察HO-1表達(dá)情況。
　　 6.脊髓組織中

8、cGMP的測(cè)定：動(dòng)物麻醉狀態(tài)下，迅速取脊髓腰膨大處組織研磨勻漿，離心，收集上清液，60℃烤箱中烘干，殘?jiān)娣庞?℃冰箱中批量測(cè)定。采用放射免疫法檢測(cè)cGMP含量。
　　 7.血清中MDA、SOD的測(cè)定：動(dòng)物麻醉狀態(tài)下，快速心臟穿刺取血2-3ml離心分離血清，標(biāo)本置于-20℃冰箱內(nèi)批量測(cè)定。MDA用硫代巴比妥酸法，SOD用黃嘌呤氧化法測(cè)定。
　　 8.信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)現(xiàn)者基因芯片檢測(cè)：取各組大鼠的脊髓腰膨大處新鮮組織，提取R

9、NA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)生成cDNA，標(biāo)記探針，與芯片雜交，加入鏈親和素耦聯(lián)的堿性磷酸酶（AP）及化學(xué)發(fā)光底物反應(yīng)。圖像采集，數(shù)據(jù)分析。
　　 結(jié)果：
　　 1.動(dòng)物復(fù)發(fā)情況觀察：EAE組動(dòng)物復(fù)發(fā)率66.7％，LA組動(dòng)物復(fù)發(fā)率33.3％，DXM組和SNPP組動(dòng)物均無(wú)復(fù)發(fā)。DXM組、LA組、SNPP組復(fù)發(fā)率均小于EAE組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。LA組與DXM組、SNPP組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　 2

10、.動(dòng)物行為學(xué)觀察：在動(dòng)物緩解期（發(fā)病后第7天）和復(fù)發(fā)期（發(fā)病后第14天）時(shí)神經(jīng)功能評(píng)分比較：（1） 緩解期：DXM組、LA組、SNPP組評(píng)分均小于EAE組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），DXM組、LA組和SNPP組之間評(píng)分比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義； （2） 復(fù)發(fā)期：LA組與EAE組評(píng)分比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），DXM組和SNPP組動(dòng)物均無(wú)復(fù)發(fā)。
　　 3.組織病理學(xué)觀察：發(fā)病后各組大鼠脊髓組織內(nèi)遍布“袖套樣”炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，以灰白

11、質(zhì)交界區(qū)較多，浸潤(rùn)細(xì)胞以淋巴細(xì)胞為主，且炎性細(xì)胞數(shù)目的多少與疾病嚴(yán)重程度相一致，發(fā)病期血管“袖套”數(shù)最多，緩解期血管“袖套”數(shù)減少，細(xì)胞浸潤(rùn)減輕，復(fù)發(fā)期幾乎很少見(jiàn)到血管袖套樣結(jié)構(gòu)，但炎細(xì)胞浸潤(rùn)仍很多，呈彌漫分布。緩解期DXM組、LA組、SNPP組血管袖套數(shù)目均明顯低于EAE組（P<0.01），但各藥物干預(yù)組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。復(fù)發(fā)期各組間血管袖套數(shù)目比較都沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　 4.脊髓HO-1表達(dá)：

12、脊髓切片免疫組化染色結(jié)果顯示，發(fā)病期陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目最多，緩解期減少，復(fù)發(fā)期陽(yáng)性細(xì)胞再次增多，并主要分布在炎性細(xì)胞浸潤(rùn)的血管“袖套樣”病變處，與病灶分布基本一致。SNPP組與DXM組、LA組、EAE組比較，同病期陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)減少，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。DXM組、LA組、EAE組三組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　 5.脊髓組織cGMP含量比較：動(dòng)物發(fā)病期cGMP含量增加，EAE組緩解期和復(fù)發(fā)期無(wú)明顯下降，而同病期的地塞

13、米松和硫辛酸干預(yù)組cGMP含量均下降。
　　 6.血清中丙二醛（MDA）含量比較：動(dòng)物發(fā)病期MDA含量增加，緩解期減少，復(fù)發(fā)期再次升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。各藥物干預(yù)組與同病期EAE組比較MDA含量均減少，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　 7.血清中超氧化物歧化酶（SOD）含量比較：動(dòng)物發(fā)病期SOD含量增加，緩解期減少均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），復(fù)發(fā)期無(wú)明顯變化。緩解期：LA組和SNPP組含量與EAE

14、組相比均升高，SNPP組更為顯著（P<0.01），DXM組與EAE組比較無(wú)明顯變化；復(fù)發(fā)期：DXM組和LA組含量與EAE組相比均升高，SNPP組反而降低。
　　 8.基因芯片分析結(jié)果：篩選出10項(xiàng)基因在比較中隨病程變化呈現(xiàn)出發(fā)病期表達(dá)上調(diào)，緩解期表達(dá)下調(diào)，復(fù)發(fā)期表達(dá)再次上調(diào)的趨勢(shì)，考慮與EAE發(fā)病有關(guān)。其中8項(xiàng)基因在DXM組中緩解期表達(dá)下調(diào)后復(fù)發(fā)期未再次上調(diào)，考慮與DXM作用有關(guān)；3 項(xiàng)基因在LA組中緩解期表達(dá)下調(diào)后復(fù)發(fā)期未再次

15、上調(diào)，考慮與LA作用有關(guān)；5項(xiàng)基因在SNPP組中緩解期表達(dá)下調(diào)后復(fù)發(fā)期未再次上調(diào)，考慮與SNPP作用有關(guān)。
　　 結(jié)論：
　　 1.硫辛酸和錫原卟啉均可以促進(jìn)EAE大鼠的病情緩解，降低動(dòng)物復(fù)發(fā)率，尤其錫原卟啉與地塞米松效果相似。
　　 2.錫原卟啉可以減少EAE大鼠脊髓組織HO-1的表達(dá)。
　　 3.EAE大鼠血清中MDA、SOD含量，脊髓中cGMP含量，脊髓中HO-1表達(dá)均與病情活動(dòng)性相關(guān)，隨病程發(fā)展呈