海洋微生物來(lái)源新型蒽環(huán)類(lèi)化合物SZ-685c抗乳腺癌活性及其作用機(jī)制研究.pdf

1、海洋，作為一種特殊的生長(zhǎng)環(huán)境，使海洋生物能夠產(chǎn)生并積累大量具有特殊化學(xué)結(jié)構(gòu)、特殊生理活性和功能的物質(zhì)，從而提供了一個(gè)豐富的新穎結(jié)構(gòu)的化合物庫(kù)。近年來(lái)，從海洋活性代謝產(chǎn)物中尋找高效的抗癌化合物，直接用于臨床或作為先導(dǎo)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，進(jìn)而開(kāi)發(fā)新的高效低毒的抗癌藥物，已經(jīng)成為抗癌藥物研發(fā)的重要領(lǐng)域。
　　 蒽環(huán)類(lèi)化合物，如表阿霉素(Epirubicin，EPI)，是目前臨床抗腫瘤一線化療藥物，尤其是乳腺癌化療中最常用的藥物，無(wú)論在乳腺

2、癌術(shù)前輔助治療、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移治療和早期乳腺癌術(shù)后輔助治療中都占有非常重要的地位。然而，由于目前臨床使用的此類(lèi)藥物毒性較高，以及耐藥性的出現(xiàn)，促使研究者不斷尋找結(jié)構(gòu)新穎的同類(lèi)化療替代藥物。
　　 來(lái)自海洋紅樹(shù)林共生微生物次生代謝產(chǎn)物的SZ-685c是一種結(jié)構(gòu)新穎的蒽環(huán)類(lèi)化合物。本論文通過(guò)體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)，研究了SZ-685c抗乳腺癌作用，并從誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞增殖、導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯、調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路等方面對(duì)其作用機(jī)理進(jìn)行了探討。<

3、br>　　 第一部分SZ-685c對(duì)人乳腺癌生長(zhǎng)的抑制作用
　　 目的：
　　 研究SZ-685c對(duì)于體外培養(yǎng)的人乳腺癌細(xì)胞MCF-7和MDA-MB-435和其他分別屬于三種不同腫瘤的六株腫瘤細(xì)胞系生長(zhǎng)的抑制作用以及SZ-685c對(duì)于裸鼠體內(nèi)乳腺癌移植瘤生長(zhǎng)的抑制作用，了解SZ-685c的抗腫瘤活性。
　　 方法：
　　 1、采用MTT法檢測(cè)不同濃度SZ-685c作用下，人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、MDA

4、-MB-435和人永生化乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A細(xì)胞活力的變化，研究SZ-685c體外抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的量效關(guān)系。
　　 2、采用MTT法檢測(cè)10μM S2-685c作用不同時(shí)間后，對(duì)人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、MDA-MB-435和人永生化乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A生長(zhǎng)的影響，研究SZ-685c體外抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的時(shí)效關(guān)系。
　　 3、將SZ-685c與臨床上廣泛應(yīng)用的蒽環(huán)類(lèi)抗腫瘤藥物EPI進(jìn)行比較，以上述方法，對(duì)于人乳腺癌

5、細(xì)胞MCF-7、MDA-MB-435和人永生化乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A生長(zhǎng)抑制活性進(jìn)行檢測(cè)。
　　 4、了解SZ-685c對(duì)于其他類(lèi)型腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用。觀察SZ-685c對(duì)人前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C-3，入神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株LN-444、U87MG、LN-18，以及人肝癌細(xì)胞株Hep-3B、Huh-7生長(zhǎng)的影響。
　　 5、研究SZ-685c在體內(nèi)對(duì)于人乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用。建立裸鼠MDA-MB-435乳腺癌移植瘤模

6、型，將荷瘤裸鼠隨機(jī)分為2組，A組：對(duì)照組，每三天腹腔注射200μl0.5％ DMSO；B組：SZ-685c實(shí)驗(yàn)組，每三天腹腔注射50 mg/kg SZ-685c(溶于200μl0.5％ DMSO)。共30天，給藥11次。
　　 結(jié)果：
　　 1、SZ-685c對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7和MDA-MB-435的生長(zhǎng)具有高效抑制作用，且呈現(xiàn)明顯的劑量依賴(lài)性，對(duì)MCF-7和MDA-MB-435作用48 hr的IC50分別為7.5

7、μM和3.0μM。而SZ-685c對(duì)人永生化乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A生長(zhǎng)的抑制作用較對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7和MDA-MB-435要小得多，其IC50為47.9μM。
　　 2、10μM SZ-685c對(duì)MCF-7和MDA-M B-435作用不同時(shí)間后，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，其抑制作用增強(qiáng)，呈顯著時(shí)間依賴(lài)性。10μM S2-685c處理72 hr后，MCF-7和MDA-MB-435的生長(zhǎng)均已受到顯著抑制，而MCF-10A的生長(zhǎng)和

8、活力與對(duì)照無(wú)顯著差異。
　　 3、與EPI比較發(fā)現(xiàn)，在20μM濃度時(shí)，SZ-685c與EPI對(duì)乳腺癌細(xì)胞系的抑制率相當(dāng)；但對(duì)人永生化乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A，在20μM時(shí)，SZ-685c尚無(wú)明顯抑制活性，而EPI對(duì)其的抑制率已達(dá)到80％。
　　 4、SZ-685c對(duì)人前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C-3，人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株LN-444、U87MG、LN-18，人肝癌細(xì)胞株Hep-3B、Huh-7的生長(zhǎng)亦具有顯著抑制作用，對(duì)于這六株腫

9、瘤細(xì)胞系作用48 hr的IC50值均小于15μM。
　　 5、經(jīng)30天給藥11次后，SZ-685c治療組裸鼠瘤重0.65±0.08 g，而對(duì)照組裸鼠瘤重為1.69±0.18 g，SZ-685c對(duì)裸鼠乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-435移植瘤的抑制率達(dá)61.36％。
　　 結(jié)論：
　　 SZ-685c對(duì)于包括人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和MDA-MB-435在內(nèi)的四種不同類(lèi)型的八株腫瘤細(xì)胞系的生長(zhǎng)均具有高效抑制作用，其抑制作

10、用呈劑量和時(shí)間依賴(lài)性。對(duì)于裸鼠體內(nèi)MDA-MB-435乳腺癌移植瘤的生長(zhǎng)，SZ-685c亦具有明顯抑制作用。
　　 第二部分 SZ-685c誘導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞的凋亡
　　 目的：
　　 研究SZ-685c對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7和MDA-MB-435凋亡的誘導(dǎo)作用，并探討其凋亡作用通路。
　　 方法：
　　 1、采用Annexin V-FITC/PI染色和TUNEL染色檢測(cè)SZ-685c對(duì)人乳腺癌細(xì)

11、胞MCF-7和MDA-MB-435凋亡的誘導(dǎo)作用。
　　 2、采用Western blotting檢測(cè)在不同濃度和不同時(shí)間的S2-685c處理后，MCF-7、MDA-MB435和MCF-10A細(xì)胞中caspase-8，-9，-3和多聚(ADP-核糖)聚合酶[poly(ADP-ribose) polerase，PARP]的變化。
　　 3、采用caspase分光光度法或熒光光度法檢測(cè)試劑盒分析SZ-685c作用后MCF-7

12、和MDA-MB-435細(xì)胞中caspase-8，-9，-3酶活性的變化。
　　 結(jié)論：
　　 SZ-685c能誘導(dǎo)MCF-7和MDA-MB-435細(xì)胞凋亡，在此過(guò)程中凋亡途徑中的一些關(guān)鍵分子如caspase-8，-9，-3被激活，從而引起PARP蛋白被切割，最終誘導(dǎo)凋亡發(fā)生。
　　 第三部分 SZ-685c通過(guò)阻滯細(xì)胞周期抑制人乳腺癌細(xì)胞增殖
　　 目的：
　　 研究SZ-685c對(duì)人乳腺癌細(xì)胞M

13、CF-7和MDA-MB-435的增殖和細(xì)胞周期的影響及其相關(guān)的分子改變。
　　 方法：
　　 1、MCF-7和MDA-MB-435經(jīng)不同濃度SZ-685c(0，50％ IC50，100％ IC50，200％ IC50)處理24 hr后，采用5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-bromodeoxyuridine，BrdU)摻入法檢測(cè)細(xì)胞增殖，顯微鏡下觀察SZ-685c對(duì)人乳腺癌細(xì)胞增殖的影響。
　　 2、收集不同濃度SZ-6

14、85c(0，50％ IC50，100％ IC50)作用24 hr后的MCF-7和MDA-MB-435細(xì)胞，碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)染色后以流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期，觀察SZ-685c對(duì)于MCF-7和MDA-MB-435細(xì)胞周期的影響。
　　 3、采用Western blotting檢測(cè)不同濃度SZ-685c(0，50％ IC50，100％ IC50，200％ IC50)作用48 hr以及200％ IC50

15、濃度的SZ-685c作用不同時(shí)間(0，16 hr，24 hr，48 hr)后，細(xì)胞周期調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白細(xì)胞周期素D1(Cyclin D1)，周期素依賴(lài)激酶4(Cyclin dependent kinases，CDK4)和p-Rb(Ser608) and p-Rb(Ser807/811)的變化。
　　 結(jié)論：
　　 S2-685c能抑制MCF-7和MDA-MB-435細(xì)胞增殖，可阻滯MCF-7和MDA-MB-435細(xì)胞從G1期

16、進(jìn)入S期，其作用機(jī)制可能是通過(guò)抑制MCF-7和MDA-MB-435細(xì)胞中Cyclin D1、CDK4的表達(dá)以及Rb的磷酸化來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
　　 第四部分 SZ-685c誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和增殖抑制的分子通路
　　 目的：
　　 通過(guò)研究SZ-685c對(duì)Akt/FoxO信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的作用，探討SZ-685c誘導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞凋亡和抑制其增殖的分子機(jī)制。
　　 方法：
　　 1、用Western blotting

17、檢測(cè)不同濃度SZ-685c(0，50％ IC50，100％ IC50，200％IC50)作用48 hr以及200％ IC50濃度的SZ-685c作用不同時(shí)間(0，16 hr，24 hr，48 hr)后，Akt磷酸化水平和總Akt的變化，以及FoxO1和FoxO3a磷酸化水平的改變。
　　 2、用Western blotting檢測(cè)SZ-685c作用對(duì)FoxO3a下游靶基因Bim表達(dá)的影響。
　　 結(jié)論：
　　 S