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文檔簡介
1、第一部分:
來曲唑誘導大鼠PCOS 動物模型的構建及基因芯片的制備篩選
目的:1.采用來曲唑灌胃方法構建雌性Wistar 大鼠PCOS 動物模型,并分析比較模型組與對照組的血清睪酮(T),雌二醇(E2)和黃體生成素(LH)水平變化,胰島素抵抗相關的特征及卵巢的形態(tài)學改變。
2.利用基因芯片的技術篩選兩組之間差異表達的microRNAs,探討其參與PCOS 發(fā)生和發(fā)展過程中的可能機制。
2、 方法:1、選取6周齡清潔級的雌性Wistar 大鼠,隨機分組為模型組和對照組,每組各20只。PCOS模型組:每日來曲唑1 mg/(kg·d)溶于1%的羧甲基纖維素(CMC)中,連續(xù)灌服21 d;對照組:不予處理,正常喂養(yǎng)。從用藥的第10天開始每日進行陰道涂片至用藥期結束,在最后一次應用來曲唑24h(并禁食12h)后,同時在處理對照組大鼠時,盡量控制其在動情間期。水合氯醛麻醉后切取卵巢,心臟取血,分離血清。全自動化學發(fā)光檢測儀測定血清
3、T,E2和LH;放射免疫學方法測定空腹血清胰島素(FINS),血糖儀測定空腹血糖(FBG),并計算胰島素抵抗指數(HOMA1-IR);稱重卵巢并測定大鼠體重;卵巢組織切片,HE 染色,并觀察其病理變化。
2.從造模成功的PCOS模型組及正常對照組中各隨機選取3只大鼠,10%的水合氯醛腹腔麻醉后,心臟取血后迅速取出雙側卵巢,稱重后將其中的一個卵巢液氮冷凍固定保存,送往北京博奧生物有限公司應用最新版本15.0的LC-scien
4、ce microRNAs表達譜微陣列芯片進行篩選microRNAs。
結果:
1.陰道涂片結果顯示模型組無明顯的動情周期的改變,大多處于動情間期,而對照組則有明顯的動情周期的變化。模型組卵巢切片HE 染色顯示:卵巢有較多的囊狀擴張卵泡,而黃體及發(fā)育階段卵泡數目明顯減少,卵泡內卵母細胞和放射冠消失,顆粒細胞層數減少或消失,卵泡膜細胞及間質細胞增生。對照組可見多個黃體及不同發(fā)育階段的卵泡,卵泡內顆粒細胞呈多層,多
5、為8-9 層。
2.與對照組比較,PCOS模型組血清T 顯著高于對照組(P<0.01),而血清FBG,FINS和HOMA1-IR 無統(tǒng)計學差異(均為P>0.05),兩組大鼠體重變化無統(tǒng)計學差異(P>0.05),去除體重影響后PCOS模型組大鼠卵巢重量顯著大于對照組(P<0.05)。
3.基因芯片結果表明,對照組與模型組兩組的卵巢之間大量有差異表達的microRNAs。與對照組比較,在模型組表達明顯增多有57個
6、microRNAs(P<0.01)其中有23個信號值較高差異較明顯,34個是信號值低于500 但是也有差異的;表達明顯減少的有43個microRNAs(P<0.01),其中20個信號值較高差異顯著,23個是信號值低于500 差異也顯著的,包括差異較大、且有證實意義的、與細胞增殖凋亡相關的mir-16,mir-21,mir-24,mir-31,mir-98,mir-125b,mir-143,mir-145,mir-150等。
7、 結論:
1.來曲唑誘導雌性Wistar 大鼠PCOS 動物模型的卵巢病理改變及血內分泌改變與PCOS 病人相似。陰道圖片也顯示出模型組無明顯的排卵周期的變化,這些改變類似于PCOS 患者的病理生理變化,但是此種模型無胰島素抵抗相關的改變征象。可以作為研究非胰島素抵抗型PCOS的動物模型。
2.模型組與正常組之間存在大量表達差異的microRNAs,說明microRNAs可能在PCOS 疾病的發(fā)生發(fā)展中有著重
8、要的作用,可以為研究PCOS 疾病的病理機制提供新的方向和線索,及進一步驗證相關microRNAs 有重要的參考價值。
第二部分:大鼠PCOS動物模型中mir-21和mir-320 含量表達的驗證
目的:結合文獻報道與基因芯片篩選結果,選擇mir-21和mir-320進行驗證,觀察它們在PCOS模型組與正常組之間的表達差異,并探討其在PCOS疾病的發(fā)生發(fā)展中的可能機制。
方法:采用實時熒光定量P
9、CR檢測兩組大鼠卵巢中mir-21和mir-320的表達水平,選擇snRNA U6 為內參照miRNA,每份標本均設2個平行復孔和1個陰性對照。
結果:熒光定量PCR結果分析顯示模型組的mir-21的表達量相對對照組的表達量約是0.48,而mir-320在兩組之間的含量相當,無明顯的差別。
結論:從real-timePCR驗證的結果我們得知,mir-21和mir-320在兩組中的含量變化與基因芯片結果相符合。
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