來曲唑誘導大鼠多囊卵巢綜合癥模型的構建及相關microRNAs的篩選驗證.pdf

1、第一部分:
　　 來曲唑誘導大鼠PCOS 動物模型的構建及基因芯片的制備篩選
　　 目的：1．采用來曲唑灌胃方法構建雌性Wistar 大鼠PCOS 動物模型，并分析比較模型組與對照組的血清睪酮（T），雌二醇（E2）和黃體生成素（LH）水平變化，胰島素抵抗相關的特征及卵巢的形態(tài)學改變。
　　 2．利用基因芯片的技術篩選兩組之間差異表達的microRNAs，探討其參與PCOS 發(fā)生和發(fā)展過程中的可能機制。
　　

2、 方法：1、選取6周齡清潔級的雌性Wistar 大鼠，隨機分組為模型組和對照組，每組各20只。PCOS模型組：每日來曲唑1 mg/（kg·d)溶于1％的羧甲基纖維素(CMC)中,連續(xù)灌服21 d；對照組：不予處理，正常喂養(yǎng)。從用藥的第10天開始每日進行陰道涂片至用藥期結束，在最后一次應用來曲唑24h(并禁食12h)后，同時在處理對照組大鼠時，盡量控制其在動情間期。水合氯醛麻醉后切取卵巢，心臟取血，分離血清。全自動化學發(fā)光檢測儀測定血清

3、T，E2和LH；放射免疫學方法測定空腹血清胰島素（FINS），血糖儀測定空腹血糖（FBG），并計算胰島素抵抗指數（HOMA1-IR）；稱重卵巢并測定大鼠體重；卵巢組織切片，HE 染色，并觀察其病理變化。
　　 2．從造模成功的PCOS模型組及正常對照組中各隨機選取3只大鼠，10％的水合氯醛腹腔麻醉后，心臟取血后迅速取出雙側卵巢，稱重后將其中的一個卵巢液氮冷凍固定保存，送往北京博奧生物有限公司應用最新版本15.0的LC-scien

4、ce microRNAs表達譜微陣列芯片進行篩選microRNAs。
　　 結果：
　　 1.陰道涂片結果顯示模型組無明顯的動情周期的改變，大多處于動情間期，而對照組則有明顯的動情周期的變化。模型組卵巢切片HE 染色顯示：卵巢有較多的囊狀擴張卵泡，而黃體及發(fā)育階段卵泡數目明顯減少，卵泡內卵母細胞和放射冠消失，顆粒細胞層數減少或消失，卵泡膜細胞及間質細胞增生。對照組可見多個黃體及不同發(fā)育階段的卵泡，卵泡內顆粒細胞呈多層，多

5、為8-9 層。
　　 2．與對照組比較，PCOS模型組血清T 顯著高于對照組（P<0.01），而血清FBG，FINS和HOMA1-IR 無統(tǒng)計學差異（均為P>0.05），兩組大鼠體重變化無統(tǒng)計學差異（P>0.05），去除體重影響后PCOS模型組大鼠卵巢重量顯著大于對照組（P<0.05）。
　　 3.基因芯片結果表明，對照組與模型組兩組的卵巢之間大量有差異表達的microRNAs。與對照組比較，在模型組表達明顯增多有57個

6、microRNAs(P<0.01)其中有23個信號值較高差異較明顯，34個是信號值低于500 但是也有差異的；表達明顯減少的有43個microRNAs(P<0.01)，其中20個信號值較高差異顯著，23個是信號值低于500 差異也顯著的，包括差異較大、且有證實意義的、與細胞增殖凋亡相關的mir-16，mir-21，mir-24，mir-31，mir-98，mir-125b，mir-143,mir-145，mir-150等。
　　

7、 結論：
　　 1．來曲唑誘導雌性Wistar 大鼠PCOS 動物模型的卵巢病理改變及血內分泌改變與PCOS 病人相似。陰道圖片也顯示出模型組無明顯的排卵周期的變化，這些改變類似于PCOS 患者的病理生理變化，但是此種模型無胰島素抵抗相關的改變征象。可以作為研究非胰島素抵抗型PCOS的動物模型。
　　 2．模型組與正常組之間存在大量表達差異的microRNAs，說明microRNAs可能在PCOS 疾病的發(fā)生發(fā)展中有著重

8、要的作用，可以為研究PCOS 疾病的病理機制提供新的方向和線索，及進一步驗證相關microRNAs 有重要的參考價值。
　　 第二部分:大鼠PCOS動物模型中mir-21和mir-320 含量表達的驗證
　　 目的：結合文獻報道與基因芯片篩選結果，選擇mir-21和mir-320進行驗證，觀察它們在PCOS模型組與正常組之間的表達差異，并探討其在PCOS疾病的發(fā)生發(fā)展中的可能機制。
　　 方法：采用實時熒光定量P

9、CR檢測兩組大鼠卵巢中mir-21和mir-320的表達水平，選擇snRNA U6 為內參照miRNA，每份標本均設2個平行復孔和1個陰性對照。
　　 結果：熒光定量PCR結果分析顯示模型組的mir-21的表達量相對對照組的表達量約是0.48，而mir-320在兩組之間的含量相當，無明顯的差別。
　　 結論：從real-timePCR驗證的結果我們得知，mir-21和mir-320在兩組中的含量變化與基因芯片結果相符合。