來(lái)曲唑誘導(dǎo)大鼠多囊卵巢綜合癥模型的構(gòu)建及相關(guān)microRNAs的篩選驗(yàn)證.pdf

1、第一部分:
　　 來(lái)曲唑誘導(dǎo)大鼠PCOS 動(dòng)物模型的構(gòu)建及基因芯片的制備篩選
　　 目的：1．采用來(lái)曲唑灌胃方法構(gòu)建雌性Wistar 大鼠PCOS 動(dòng)物模型，并分析比較模型組與對(duì)照組的血清睪酮（T），雌二醇（E2）和黃體生成素（LH）水平變化，胰島素抵抗相關(guān)的特征及卵巢的形態(tài)學(xué)改變。
　　 2．利用基因芯片的技術(shù)篩選兩組之間差異表達(dá)的microRNAs，探討其參與PCOS 發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中的可能機(jī)制。
　　

2、 方法：1、選取6周齡清潔級(jí)的雌性Wistar 大鼠，隨機(jī)分組為模型組和對(duì)照組，每組各20只。PCOS模型組：每日來(lái)曲唑1 mg/（kg·d)溶于1％的羧甲基纖維素(CMC)中,連續(xù)灌服21 d；對(duì)照組：不予處理，正常喂養(yǎng)。從用藥的第10天開(kāi)始每日進(jìn)行陰道涂片至用藥期結(jié)束，在最后一次應(yīng)用來(lái)曲唑24h(并禁食12h)后，同時(shí)在處理對(duì)照組大鼠時(shí)，盡量控制其在動(dòng)情間期。水合氯醛麻醉后切取卵巢，心臟取血，分離血清。全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀測(cè)定血清

3、T，E2和LH；放射免疫學(xué)方法測(cè)定空腹血清胰島素（FINS），血糖儀測(cè)定空腹血糖（FBG），并計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)（HOMA1-IR）；稱重卵巢并測(cè)定大鼠體重；卵巢組織切片，HE 染色，并觀察其病理變化。
　　 2．從造模成功的PCOS模型組及正常對(duì)照組中各隨機(jī)選取3只大鼠，10％的水合氯醛腹腔麻醉后，心臟取血后迅速取出雙側(cè)卵巢，稱重后將其中的一個(gè)卵巢液氮冷凍固定保存，送往北京博奧生物有限公司應(yīng)用最新版本15.0的LC-scien

4、ce microRNAs表達(dá)譜微陣列芯片進(jìn)行篩選microRNAs。
　　 結(jié)果：
　　 1.陰道涂片結(jié)果顯示模型組無(wú)明顯的動(dòng)情周期的改變，大多處于動(dòng)情間期，而對(duì)照組則有明顯的動(dòng)情周期的變化。模型組卵巢切片HE 染色顯示：卵巢有較多的囊狀擴(kuò)張卵泡，而黃體及發(fā)育階段卵泡數(shù)目明顯減少，卵泡內(nèi)卵母細(xì)胞和放射冠消失，顆粒細(xì)胞層數(shù)減少或消失，卵泡膜細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞增生。對(duì)照組可見(jiàn)多個(gè)黃體及不同發(fā)育階段的卵泡，卵泡內(nèi)顆粒細(xì)胞呈多層，多

5、為8-9 層。
　　 2．與對(duì)照組比較，PCOS模型組血清T 顯著高于對(duì)照組（P<0.01），而血清FBG，F(xiàn)INS和HOMA1-IR 無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均為P>0.05），兩組大鼠體重變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），去除體重影響后PCOS模型組大鼠卵巢重量顯著大于對(duì)照組（P<0.05）。
　　 3.基因芯片結(jié)果表明，對(duì)照組與模型組兩組的卵巢之間大量有差異表達(dá)的microRNAs。與對(duì)照組比較，在模型組表達(dá)明顯增多有57個(gè)

6、microRNAs(P<0.01)其中有23個(gè)信號(hào)值較高差異較明顯，34個(gè)是信號(hào)值低于500 但是也有差異的；表達(dá)明顯減少的有43個(gè)microRNAs(P<0.01)，其中20個(gè)信號(hào)值較高差異顯著，23個(gè)是信號(hào)值低于500 差異也顯著的，包括差異較大、且有證實(shí)意義的、與細(xì)胞增殖凋亡相關(guān)的mir-16，mir-21，mir-24，mir-31，mir-98，mir-125b，mir-143,mir-145，mir-150等。
　　

7、 結(jié)論：
　　 1．來(lái)曲唑誘導(dǎo)雌性Wistar 大鼠PCOS 動(dòng)物模型的卵巢病理改變及血內(nèi)分泌改變與PCOS 病人相似。陰道圖片也顯示出模型組無(wú)明顯的排卵周期的變化，這些改變類似于PCOS 患者的病理生理變化，但是此種模型無(wú)胰島素抵抗相關(guān)的改變征象。可以作為研究非胰島素抵抗型PCOS的動(dòng)物模型。
　　 2．模型組與正常組之間存在大量表達(dá)差異的microRNAs，說(shuō)明microRNAs可能在PCOS 疾病的發(fā)生發(fā)展中有著重

8、要的作用，可以為研究PCOS 疾病的病理機(jī)制提供新的方向和線索，及進(jìn)一步驗(yàn)證相關(guān)microRNAs 有重要的參考價(jià)值。
　　 第二部分:大鼠PCOS動(dòng)物模型中mir-21和mir-320 含量表達(dá)的驗(yàn)證
　　 目的：結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道與基因芯片篩選結(jié)果，選擇mir-21和mir-320進(jìn)行驗(yàn)證，觀察它們?cè)赑COS模型組與正常組之間的表達(dá)差異，并探討其在PCOS疾病的發(fā)生發(fā)展中的可能機(jī)制。
　　 方法：采用實(shí)時(shí)熒光定量P

9、CR檢測(cè)兩組大鼠卵巢中mir-21和mir-320的表達(dá)水平，選擇snRNA U6 為內(nèi)參照miRNA，每份標(biāo)本均設(shè)2個(gè)平行復(fù)孔和1個(gè)陰性對(duì)照。
　　 結(jié)果：熒光定量PCR結(jié)果分析顯示模型組的mir-21的表達(dá)量相對(duì)對(duì)照組的表達(dá)量約是0.48，而mir-320在兩組之間的含量相當(dāng)，無(wú)明顯的差別。
　　 結(jié)論：從real-timePCR驗(yàn)證的結(jié)果我們得知，mir-21和mir-320在兩組中的含量變化與基因芯片結(jié)果相符合。