NMDA受體信號通路在暈動癥適應(yīng)-脫適應(yīng)過程中的作用及機制.pdf

1、暈動癥是由于人體暴露于異常加速度環(huán)境所引起的多系統(tǒng)生理反應(yīng)。反復(fù)暴露于該加速度環(huán)境，能使得暈動癥癥狀減輕甚至消失，這就是適應(yīng)現(xiàn)象。脫離加速度環(huán)境一定時間后，會出現(xiàn)脫適應(yīng)現(xiàn)象。但是這種適應(yīng)脫適應(yīng)的周期性規(guī)律和其中樞機制卻不清楚。眾所周知，前庭系統(tǒng)是外界加速度信息的主要感受系統(tǒng)，前人的研究發(fā)現(xiàn)在前庭神經(jīng)元中，谷氨酸是主要的神經(jīng)遞質(zhì)，而NMDA受體也廣泛地存在于前庭核的神經(jīng)元中。大量的研究表明，NMDA受體介導(dǎo)的長時程增強是中樞學(xué)習(xí)記憶的神經(jīng)

2、基礎(chǔ)，NMDA受體介導(dǎo)的胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)反應(yīng)主要是通過谷氨酸激活NMDA受體后通過鈣/鈣調(diào)蛋白依賴型激酶Ⅱ(Ca2+/CaMKⅡ)途徑，最終激活cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)，而磷酸化的CREB也作為轉(zhuǎn)錄因子可進一步誘導(dǎo)及早基因c-fos以及腦源性神經(jīng)生長因子(BDNF)等新基因的表達。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)Fos蛋白能作為前庭核神經(jīng)元激活的分子標(biāo)志，并且谷氨酸能神經(jīng)元前庭內(nèi)臟投射通路能被旋轉(zhuǎn)刺激所激活。另外，大量研究證實，海馬是記憶

3、相關(guān)的重要腦區(qū)，前庭與海馬之間存在著廣泛的聯(lián)系，前庭系統(tǒng)的激活能影響海馬的功能和海馬相關(guān)的學(xué)習(xí)記憶能力。本研究首先觀察了暈動癥大鼠的行為學(xué)變化和適應(yīng)-脫適應(yīng)規(guī)律，進一步采用分子生物學(xué)方法觀察NMDA受體信號通路在暈動癥適應(yīng)-脫適應(yīng)過程中的變化，最后采用藥理學(xué)手段阻斷該信號通路，觀察對暈動癥適應(yīng)-脫適應(yīng)過程的影響。
　　 方法:
　　 一、暈動癥適應(yīng)-脫適應(yīng)動物模型的建立
　　 1、實驗動物及分組
　　 5

4、50只健康雄性SD大鼠，體重220-250g。
　　 (1)長時刺激實驗
　　 100只動物完全隨機分為10組：旋轉(zhuǎn)刺激4h組，靜止對照4h組，1h旋轉(zhuǎn)組，1h靜止組，2h旋轉(zhuǎn)組，2h靜止組，3h旋轉(zhuǎn)組，3h靜止組，4h旋轉(zhuǎn)組，4h靜止組，每組10只。前2組記錄每小時的實時行為學(xué)變化，后8組記錄自發(fā)活動變化。
　　 (2)東莨菪堿干預(yù)實驗
　　 90只動物完全隨機分為9組：自由活動對照組，靜止對照組，旋轉(zhuǎn)

5、對照組，東莨菪堿旋轉(zhuǎn)組Ⅰ(Sco0.5mg/kg)，東莨菪堿靜止組Ⅰ，東莨菪堿旋轉(zhuǎn)組Ⅱ(Sco1.0mg/kg)，東莨菪堿靜止組Ⅱ，溶劑旋轉(zhuǎn)組，溶劑靜止組，每組10只。藥物及溶劑組為刺激前30min給藥(1ml/只，i.g.)。
　　 (3)雙側(cè)迷路切除實驗
　　 40只動物完全隨機分為4組：雙側(cè)迷路切除旋轉(zhuǎn)組，雙側(cè)迷路切除靜止組，假手術(shù)旋轉(zhuǎn)組，假手術(shù)靜止組，每組10只。手術(shù)后4周進行刺激實驗。
　　 (4)適應(yīng)

6、規(guī)律實驗
　　 40只動物完全隨機分為2組：旋轉(zhuǎn)刺激2h/d組、靜止對照2h/d組，每組20只，每天進行模擬暈動刺激，實時觀察行為學(xué)變化。
　　 100只動物完全隨機分為10組：旋轉(zhuǎn)刺激2h-1d組、2h-4d組、2h-7d組、2h-10d組、2h-13d組，和與各自時間對應(yīng)的靜止對照組，每組10只，記錄自發(fā)活動變化。
　　 (5)脫適應(yīng)規(guī)律實驗
　　 180只動物完全隨機分為18組：脫適應(yīng)5d，7d，1

7、4d，21d，28d，35d組及相應(yīng)天數(shù)刺激對照組，靜止對照組，每組10只。脫適應(yīng)組動物首先進行暈動刺激至適應(yīng)，連續(xù)9d，每天2h，后正常飼養(yǎng)至相應(yīng)脫適應(yīng)天數(shù)，再進行一次2h暈動刺激，記錄實時行為學(xué)變化和自發(fā)活動變化。
　　 2、雙側(cè)迷路切除手術(shù)及假手術(shù)
　　 3％戊巴比妥那麻醉后，將大鼠側(cè)臥位置于手術(shù)顯微鏡下，剪開耳后皮膚，鈍性分離軟組織，暴露外耳道外壁，剪開外耳道，暴露鼓膜及鼓室，觀察聽小骨清晰后，尋找圓窗及卵圓窗，

8、用五號注射器針頭挑開鼓泡，除去部分骨質(zhì)，用尖頭鑷探查內(nèi)耳，剪除內(nèi)耳骨部，挑出內(nèi)耳，用左氧氟沙星粉劑敷于內(nèi)耳，防止感染，縫合外耳道及耳后部皮膚，存活24h后，重新進行另一側(cè)內(nèi)耳切除手術(shù)。假手術(shù)過程與雙側(cè)內(nèi)耳切除手術(shù)相同，區(qū)別在于剪除內(nèi)耳骨部后，不觸及內(nèi)耳半規(guī)管。動物正常飼養(yǎng)恢復(fù)4周后，進行旋轉(zhuǎn)刺激。
　　 3、模擬暈動癥刺激及行為學(xué)測量
　　 暈動癥模擬器根據(jù)Crampton等的報道仿制而成。將代謝盒放入暈動癥模擬器的有機

9、玻璃籠內(nèi)，旋轉(zhuǎn)刺激組大鼠無束縛的放置于代謝盒的鐵絲網(wǎng)上進行旋轉(zhuǎn)刺激。
　　 實時行為學(xué)測量：刺激結(jié)束后，立即計量鐵絲網(wǎng)上的糞便顆粒數(shù)、尿液槽中的尿液量、飼料槽中飼料攝入量、高嶺土槽中高嶺土攝入量。高嶺土攝入量(24h)測量：每天10:00自動動物代謝監(jiān)測系統(tǒng)(CLAMS)自動記錄。自發(fā)活動測量：采用DigBehav動物行為分析系統(tǒng)記錄動物3min的運動。
　　 二、前庭核NMDA受體信號通路在暈動癥適應(yīng)-脫適應(yīng)過程中的作

10、用
　　 1、實驗動物及分組
　　 128只健康雄性SD大鼠，體重220-250g。80只動物完全隨機分為10組：旋轉(zhuǎn)刺激組1d，4d，7d，10d，13d及相應(yīng)的靜止對照組，每組8只，用于進行westernblot和實時定量PCR實驗。48只動物完全隨機分為6組：旋轉(zhuǎn)刺激組1d，4d，7d，10d，13d及靜止對照組，每組8只，用于進行免疫組織化學(xué)及免疫熒光組織化學(xué)實驗。
　　 2、分子生物學(xué)實驗
　　

11、 采用Westernblot法測定尾側(cè)前庭核內(nèi)NMDAR1受體、NMDAR2A/B受體、GABAAα1亞基、CaMKⅡα亞基、磷酸化CaMKⅡα亞基、CREB、磷酸化CREB蛋白含量。
　　 采用實時定量PCR法測定尾側(cè)前庭核內(nèi)Fos、Arc、BDNFmRNA表達水平。
　　 采用免疫組織化學(xué)法觀察尾側(cè)前庭核內(nèi)Fos標(biāo)記神經(jīng)元數(shù)量。
　　 采用免疫熒光組織化學(xué)法觀察尾側(cè)前庭核內(nèi)GABAAα1標(biāo)記神經(jīng)元、Arc標(biāo)記

12、神經(jīng)元、GABAAα1/Arc共標(biāo)記神經(jīng)元數(shù)量。
　　 三、海馬NMDA受體信號通路在暈動癥適應(yīng)-脫適應(yīng)過程中的作用
　　 1、實驗動物及分組
　　 260只健康雄性SD大鼠，體重220-250g。80只動物完全隨機分為10組：旋轉(zhuǎn)刺激組1d，4d，7d，10d，13d及相應(yīng)的靜止對照組，每組8只，用于進行westernblot和實時定量PCR實驗。30只動物完全隨機分為6組：脫適應(yīng)組1d，4d，7d，14d，2

13、1d及靜止對照組(Sta)，每組5只，用于進行westernblot實驗。150只動物完全隨機分為15組：抑制劑組2d，4d，6d，8d，10d及相應(yīng)生理鹽水對照組、脫適應(yīng)對照組，每組10只。
　　 2、雙側(cè)海馬內(nèi)微注射
　　 3％戊巴比妥那麻醉后，將大鼠頭部固定于腦立體定位儀上，切開顱頂部皮膚，暴露前囟點，以前囟點為原點定位雙側(cè)海馬中心部(AP3.8mm；ML2.3mm；DV3.0mm)，打開顱骨，插入進樣導(dǎo)管，牙科水

14、泥固定導(dǎo)管于顱骨表面，左氧氟沙星粉劑敷于顱骨表面，縫合顱頂部皮膚，蓋上導(dǎo)管帽。后正常飼養(yǎng)7d，前3d每天腹腔注射1ml左氧氟沙星注射液防治感染。乙醚麻醉大鼠后，打開導(dǎo)管帽，以注射管將0.5μl20nmol/μlKN-93緩慢注射至海馬中心部，留針1min，緩慢拔針，蓋上導(dǎo)管帽。
　　 3、行為學(xué)實驗
　　 旋轉(zhuǎn)刺激同第一部分，所有動物首先進行連續(xù)9d，每天2h的暈動刺激至適應(yīng)；抑制劑組與生理鹽水對照組動物每天雙側(cè)海馬內(nèi)微

15、注射CaMKⅡ抑制劑KN-93或生理鹽水至相應(yīng)脫適應(yīng)天數(shù)后，進行2h暈動刺激記錄實時行為學(xué)變化及自發(fā)活動變化；脫適應(yīng)對照組正常飼養(yǎng)至相應(yīng)脫適應(yīng)天數(shù)后，進行2h暈動刺激記錄實時行為學(xué)變化及自發(fā)活動變化。
　　 4、分子生物學(xué)實驗
　　 采用Westernblot法測定海馬內(nèi)NMDAR1受體、NMDAR2A/B、CaMKⅡα亞基、磷酸化CaMKⅡα亞基、CREB、磷酸化CREB蛋白含量。采用實時定量熒光PCR法測定海馬內(nèi)Fo

16、s、Arc、BDNFmRNA表達水平。
　　 四、統(tǒng)計學(xué)分析
　　 采用SPSSv13.0軟件進行統(tǒng)計分析。適應(yīng)規(guī)律、脫適應(yīng)規(guī)律、Westernblot及PCR實驗中，兩因素多水平方差分析用來統(tǒng)計整個處理過程中旋轉(zhuǎn)刺激、時間的主因素效應(yīng)和交互作用效應(yīng)有無顯著性差異。當(dāng)交互效應(yīng)存在的情況下，單因素方差分析及Bonferroni檢驗用來分析相對應(yīng)的時間點，旋轉(zhuǎn)刺激組和靜止對照組之間的差異。
　　 行為學(xué)指標(biāo)篩選實驗中

17、，方差分析Bonferroni檢驗用來分析相對應(yīng)的時間點，旋轉(zhuǎn)刺激組和靜止對照組之間的差異。
　　 免疫組織化學(xué)及免疫熒光組織化學(xué)實驗中，單因素方差分析及Dunnett-t檢驗用來統(tǒng)計尾側(cè)前庭核中標(biāo)記神經(jīng)元數(shù)目有無差別。
　　 結(jié)果:
　　 一、暈動癥適應(yīng)-脫適應(yīng)動物模型的建立
　　 1、長時刺激對暈動癥行為學(xué)的影響
　　 統(tǒng)計分析顯示，與靜止對照組(Sta)相比，糞便顆粒數(shù)在刺激的第1、2小時增

18、加(P<0.05)，在第3、4小時下降至對照水平(P>0.05)：自發(fā)活動量和活動次數(shù)均在第1、2小時降低(P<0.05)，在第3、4小時上升到接近對照組水平(P>0.05)：24h高嶺土攝入量在4h中均增加(P<0.05)。尿液量無顯著變化(P>0.05)。
　　 2、東莨菪堿對暈動癥行為學(xué)的影響
　　 統(tǒng)計分析顯示，與溶劑組相比，給予東莨菪堿0.5mg/kg和1.0mg/kg后，兩個劑量均可以減少糞便顆粒數(shù)與24h高

19、嶺土攝入量，增加自發(fā)活動量和活動次數(shù)(P<0.05)。由于灌胃給予溶液的原因，使得所有動物的尿液量均增加(P<0.05)。
　　 3、雙側(cè)內(nèi)耳切除術(shù)對暈動癥行為學(xué)的影響
　　 統(tǒng)計分析顯示，雙側(cè)迷路切除組動物的糞便顆粒數(shù)、24h高嶺土攝入量、自發(fā)活動量和自發(fā)活動次數(shù)均與靜止對照組無明顯差別(P>0.05)，與暈動刺激對照組有差別(P<0.05)；假手術(shù)組動物各指標(biāo)均與暈動刺激對照組無差別(P>0.05)。
　　

20、4、適應(yīng)規(guī)律觀察實驗
　　 統(tǒng)計分析顯示暈動刺激組和靜止對照組動物的糞便顆粒數(shù)在暈動刺激第1天到第8天有顯著差異(P<0.05)，在第9天到第14天無差別(P>0.05)；實時高嶺土攝入量在暈動刺激第3天到第27天有顯著差異(P<0.05)，在第29天到第33天無差別(P>0.05)；24h高嶺土攝入量在暈動刺激第3天到第29天有顯著差異(P<0.05)，在第31天到第33天無差別(P>0.05)。與靜止對照組相比，自發(fā)活動量和

21、活動次數(shù)均在暈動刺激第1、4天降低(P<0.05)，第7天恢復(fù)到對照組水平(P>0.05)。
　　 5、脫適應(yīng)規(guī)律觀察實驗
　　 糞便顆粒數(shù)在脫適應(yīng)5d仍維持在靜止對照組水平(P>0.05)，在脫適應(yīng)7d達到旋轉(zhuǎn)對照組水平。自發(fā)活動量和活動次數(shù)隨著脫適應(yīng)天數(shù)的增加而增加，在第21天顯示與旋轉(zhuǎn)對照組無明顯差異(P>0.05)，這說明其已經(jīng)達到脫適應(yīng)水平。其它指標(biāo)也顯示部分脫適應(yīng)組與對照組有差別，但都沒有規(guī)律性。
　　

22、 二、前庭核NMDA受體信號通路在暈動癥適應(yīng)-脫適應(yīng)過程中的作用
　　 1、暈動癥適應(yīng)過程中尾側(cè)前庭核NR1、NR2A/B、GABAAα1蛋白水平和αCaMKⅡ、CREB蛋白磷酸化水平的變化
　　 統(tǒng)計分析顯示旋轉(zhuǎn)刺激組動物的GABAAα1蛋白水平、αCaMKⅡ蛋白磷酸化水平在暈動刺激第1、4天增加(P<0.05)，第7天恢復(fù)到靜止對照組水平(P>0.05)；CREB蛋白磷酸化水平在暈動刺激第1、4、7、10天增加(P

23、<0.05)，第13天恢復(fù)到靜止對照組水平(P>0.05)；NRl和NR2A/B蛋白水平無顯著變化(P>0.05)。
　　 2、暈動癥適應(yīng)過程中尾側(cè)前庭核Fos、Arc和BDNFmRNA表達水平的變化
　　 統(tǒng)計分析顯示旋轉(zhuǎn)刺激組動物的FosmRNA表達水平在暈動刺激第1、4天增加(P<0.05)，ArcmRNA表達水平在暈動癥第1、4天減少(P<0.05)，均在第7天恢復(fù)到靜止對照水平(P>0.05)；BDNFmRNA

24、表達水平無顯著變化(P>0.05)。
　　 3、暈動癥適應(yīng)過程中Fos在尾側(cè)前庭核神經(jīng)元中表達的變化
　　 方差分析顯示SpVe和MVe中的Fos標(biāo)記神經(jīng)元在旋轉(zhuǎn)刺激組和對照組之間均有顯著差別(P<0.01)。Dunnett-ttest顯示在暈動刺激第1、4、7天，F(xiàn)os標(biāo)記神經(jīng)元增加(P<0.05)，在刺激第10天起恢復(fù)到對照水平(P>0.05)。
　　 4、暈動癥適應(yīng)過程中GABAAlα1和Arc在尾側(cè)前庭核

25、神經(jīng)元中共表達
　　 方差分析顯示Arc標(biāo)記神經(jīng)元、GABAAα1標(biāo)記神經(jīng)元和GABAAα1/Arc共標(biāo)記神經(jīng)元在旋轉(zhuǎn)刺激組和對照組之間有顯著差別(p<0.01)。Dunnett-ttest顯示在暈動刺激第1、4天，GABAAα1標(biāo)記神經(jīng)元增加(P<0.05)，Arc標(biāo)記神經(jīng)元和GABAaα1/Arc共標(biāo)記神經(jīng)元減少(P<0.05)，在刺激第7天起恢復(fù)到對照水平(P>0.05)。
　　 三、海馬NMDA受體信號通路在暈動

26、癥適應(yīng)-脫適應(yīng)過程中的作用
　　 1、暈動癥適應(yīng)過程中海馬NR1、NR2A/B蛋白水平和αCaMKⅡ、CREB蛋白磷酸化水平的變化
　　 統(tǒng)計分析顯示，旋轉(zhuǎn)刺激組動物αCaMKⅡ蛋白磷酸化水平在暈動刺激第1、4、7、10天無顯著變化(P>0.05)，第13天升高(P<0.05)；CREB蛋白磷酸化水平在暈動刺激第1、4、7、10天緩慢增加(P>0.05)，第13天與靜止對照組相比顯著升高(P<0.05)；NR1和NR2A

27、/B蛋白水平無顯著變化(P>0.05)。
　　 2、暈動癥適應(yīng)過程中海馬Fos、Arc和BDNFmRNA表達水平的變化
　　 統(tǒng)計分析顯示，F(xiàn)os、Arc、BDNFmRNA表達水平在旋轉(zhuǎn)刺激組和靜止對照組之間無明顯差別(P>0.05)。
　　 3、暈動癥脫適應(yīng)過程中海馬αCaMKⅡ、CREB蛋白磷酸化水平變化
　　 統(tǒng)計分析顯示，αCaMKⅡ蛋白磷酸化水平在脫適應(yīng)第1天無明顯變化(P>0.05)，在第4、

28、7、14天升高(P<0.05)，第21天恢復(fù)到對照水平(P>0.05)。
　　 統(tǒng)計分析顯示，CREB蛋白磷酸化水平在暈動刺激第1、4天升高(P<0.05)，第7、14、21天恢復(fù)到對照水平(P00.05)。
　　 4、KN-93對暈動癥脫適應(yīng)行為學(xué)的影響
　　 統(tǒng)計分析顯示，糞便顆粒數(shù)、自發(fā)活動量、活動次數(shù)在各時間點的生理鹽水組和脫適應(yīng)組之間均無差別(P>0.05)。抑制劑組動物的糞便顆粒數(shù)在脫適應(yīng)6、8、10

29、d增加(P<0.05)，自發(fā)活動量在脫適應(yīng)6、10d降低(P<0.05)，活動次數(shù)在脫適應(yīng)6、8、10d降低(P<0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1、與異嗜高嶺土行為比較，排便量和自發(fā)活動是大鼠暈動癥判斷較為敏感和可靠的指標(biāo)，其中糞便顆粒計數(shù)操作簡單，不易出現(xiàn)測量誤差；暈動刺激后的自發(fā)活動也是暈動癥敏感的行為學(xué)指標(biāo)，綜合運用這些指標(biāo)有利于提高大鼠暈動癥嚴重程度判斷的準確性，是較為可靠的暈動癥行為學(xué)實驗方法；24h高嶺土

30、攝入量作為使用廣泛的指標(biāo)，也能反映大鼠暈動癥癥狀，但其表現(xiàn)具有一定的延遲性。
　　 2、糞便顆粒數(shù)的適應(yīng)時間為9d，脫適應(yīng)時間為7d；自發(fā)活動量和活動次數(shù)的適應(yīng)時間為7d，脫適應(yīng)時間為21d。指標(biāo)不一致的原因可能是由于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和自主神經(jīng)系統(tǒng)反映的不一致性引起的，因此，暈動癥完全適應(yīng)時間為9d，完全脫適應(yīng)時間為21d。
　　 3、在暈動癥癥狀期(1、4d)，大鼠尾側(cè)前庭核中CaMKⅡα、CREB活性和FosmRNA、蛋

31、白表達水平升高，GABAAα1受體蛋白水平升高，ArcmRNA表達水平下降；在適應(yīng)期(13d)，CaMKⅡα活性，F(xiàn)os、ArcmRNA表達水平和Fos、GABAAα1受體蛋白水平均恢復(fù)到對照組水平。并且這些分子的改變與暈動癥適應(yīng)過程中行為學(xué)改變有明顯相關(guān)性，說明大鼠尾側(cè)前庭核中NMDA受體信號通路活性和GABAAα1受體水平的升高與暈動癥適應(yīng)的形成是相關(guān)的，可能為暈動癥的適應(yīng)提供了分子基礎(chǔ)。
　　 4、在暈動癥適應(yīng)期，大鼠海馬