經蛛網(wǎng)膜下腔移植神經祖細胞治療脊髓頓挫傷的實驗研究.pdf

1、目的：探討神經祖細胞（NPCs）培養(yǎng)方法及傳10代培養(yǎng)后的細胞特點，同時觀察有血清培養(yǎng)基培養(yǎng)后活體外NPCs的分化情況。將未分化NPCs行不同時間（急性期、亞急性期及慢性期）經蛛網(wǎng)膜下腔移植神經祖細胞治療脊髓頓挫傷的效果，尋找該途徑NPCs移植的最佳時機，為臨床研究提供實驗數(shù)據(jù)。
　　方法：采用撿栓法確定綠色熒光轉基因大鼠懷孕時間為14±0.5d，取胚胎轉基因鼠腦泡，消化為單個細胞后置入包被了層粘連蛋白的培養(yǎng)瓶中，用干細胞培養(yǎng)基培

2、養(yǎng)，每3~5d傳代，共傳10代（P10）備用。P10細胞爬片后分別用nestin,A2B5,NeuN,GFAP,NF及O4染色，觀察神經標記物的表達情況，并做細胞活性鑒定。136只成年雌性大鼠，體重250–300g，用ImpactorII（NYU）建立脊髓頓挫傷大鼠模型，隨機分為為7組：急性期細胞移植組（A),亞急性期細胞移植組(S),慢性期細胞移植組（C),每組均設培養(yǎng)基對照組(MA,MS,MC)及空白對照組(N)。取P10代NPCs

3、，按照上述分組于損傷即刻、損傷后7d及損傷后4周經腰穿將NPCs移植入大鼠蛛網(wǎng)膜下腔，每組隨機取3只于細胞移植后1周、2周、4周、8周及試驗結束時取材觀察椎管內細胞存活及遷移情況，于并于模型建立后每組隨機取10只行BBB評分至實驗結束，所得數(shù)據(jù)采用Spss軟件分析，進行重復測量數(shù)據(jù)方差分析，兩兩比較采用t檢驗。
　　結果：在無分化培養(yǎng)基中，NPCs表現(xiàn)為小圓形祖細胞狀態(tài)。移植前NPCs表達A2B5和Nestin，不表達NeuN、G

4、FAP及O4。有血清培養(yǎng)基培養(yǎng)7天后少量細胞可分化為星形膠質細胞及少突膠質細胞，神經元少見。A組在細胞移植后4周可以觀察到移植細胞遷移入損傷區(qū)脊髓實質內，移植的NPCs沿著組織間隙向損傷區(qū)脊髓實質內遷移，尤其是白質纖維間隙遷移，損傷區(qū)吻側及尾側軟腦膜與硬脊膜上均可見細胞團附著，尤其在馬尾區(qū)細胞團較多，但是A組在8周及終末取材時（12周）未能見到存活的綠色熒光細胞。S組大鼠在細胞移植4周內均可見到移植的NPCs，但未見到移植細胞侵入損傷區(qū)

5、或完整脊髓實質內，但S組在細胞移植后8周及終末取材時未能見到存活的綠色熒光細胞。C組在細胞移植后8周內均可見移植的NPCs團附著于軟腦膜或硬脊膜上，以馬尾區(qū)細胞團附著較多，而損傷區(qū)吻側細胞附著較少，未見到移植的NPCs向脊髓實質內遷移，但馬尾區(qū)細胞團內部分細胞可表達GFAP及O4。對照組均未見到移植的NPCs。各組其他腦組織中如海馬、紋狀體及側腦室中均未見到移植的細胞，也沒有移植的NPCs遷移入腦實質現(xiàn)象。A組在細胞移植后2周~12周時

6、BBB評分比S組、C組及N組有明顯提高(P＜0.01)。SCI建模4周~12周S組、C組及N組間比較差異均無顯著性(P＞0.05)；細胞移植后4周為時間點，A組BBB評分均高于S組、C組及N組，差異有顯著性(P＜0.01)，但S組與C組及N組對應時間點間比較，BBB評分無差異(P＞0.05)。
　　結論：神經祖細胞體外培養(yǎng)傳代至少可傳代10次以上；通過蛛網(wǎng)膜下腔進行NPCs移植治療脊髓損傷需要考慮時間窗的問題，急性期進行細胞移植，