C型凝集素CLEC4M對(duì)負(fù)載HCV免疫分子的影響.pdf

1、丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）感染是當(dāng)今最受關(guān)注的世界性公共健康問題之一，同時(shí)是嚴(yán)重危害人類健康的常見病和多發(fā)病。根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查和世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，全世界超過1.7億人感染 HCV。初次感染HCV后，約有70％～80%的患者發(fā)展成慢性感染，甚至發(fā)展為肝纖維化、肝硬化、肝細(xì)胞癌。中國(guó)是HCV感染大國(guó)，約有3000萬人群感染，占全球感染總?cè)藬?shù)的1/5，居世界之首，嚴(yán)重危害我國(guó)人口健康。根據(jù)我國(guó)國(guó)情及HCV患者的

2、基因型等，HCV感染者治療方案仍以 Peg-IFN-α聯(lián)合 RBV為主。自2012年起，慢性丙型肝炎被列為國(guó)家十二個(gè)重點(diǎn)疾病之一。
　　肝臟是HCV感染人體的主要靶器官。HCV感染肝細(xì)胞是一個(gè)需要多種細(xì)胞表面受體分子復(fù)合物參與的復(fù)雜過程，具體機(jī)制尚未完全闡明。由于缺乏理想的動(dòng)物模型，對(duì)HCV致病機(jī)制的研究存在許多困難。近年來HCV體外培養(yǎng)系統(tǒng)的建立及轉(zhuǎn)基因小鼠動(dòng)物模型的不斷更新，促進(jìn)了HCV的研究走向深入。HCV感染肝細(xì)胞，通過病

3、毒包膜蛋白E1和E2與細(xì)胞表面受體CD81、B族I型清道夫受體（SR-BI)、緊密連接蛋白家族即CLDN-1和Occludin等分子的結(jié)合，逃逸機(jī)體的免疫監(jiān)視。最新研究發(fā)現(xiàn)，C型凝集素CLEC4M（以下簡(jiǎn)稱CLEC4M）可能是介導(dǎo)HCV入胞的重要分子。CLEC4M是一種外源 C型植物血凝素的 II型跨膜蛋白，基因定位于19p13.3，分子量為46kDa。CLEC4M專一地、大量地選擇性表達(dá)于成熟與未成熟的肝竇內(nèi)皮細(xì)胞、淋巴竇內(nèi)皮細(xì)胞及胎

4、盤毛細(xì)血管。天然配體 ICAM-3主要表達(dá)于 T細(xì)胞上，外源性抗原經(jīng)加工提呈后可以被大量的T細(xì)胞受體（TCRs）識(shí)別。
　　樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）是迄今為止所知的功能最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞，刺激初始型T細(xì)胞活化和增殖是DC的標(biāo)志性特征，在免疫反應(yīng)中起著舉足輕重的作用。DC與病毒感染是近年研究熱點(diǎn)，其抗感染的功能主要是通過識(shí)別病原體結(jié)構(gòu)分子，啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，激活特異性免疫反應(yīng)，表現(xiàn)為細(xì)胞因子或趨化因子分

5、泌水平的變化。然而DC是一把雙刃劍，呈遞抗原的同時(shí)又成為病毒的傳播者，充當(dāng)了“特洛伊木馬”的作用。本課題前期實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，DC表面可以大量表達(dá)CLEC4M分子。因此，我們推測(cè)，CLEC4M可能參與HCV的入胞過程，逃逸宿主的免疫攻擊，從而影響T細(xì)胞的免疫功能調(diào)控，而這可能是HCV慢性化的重要原因之一。為了進(jìn)一步研究負(fù)載HCV后的CLEC4M對(duì)機(jī)體免疫應(yīng)答水平的影響，本實(shí)驗(yàn)在國(guó)家自然科學(xué)基金（No：81170390）資助下進(jìn)行了以下工作：

6、
　　1．慢性丙型肝炎患者外周血單個(gè)核細(xì)胞CLEC4M的檢測(cè)及臨床意義提取人外周血單個(gè)核細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HCV初治患者、早期病毒學(xué)應(yīng)答組、持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答組和健康對(duì)照組的 CLEC4M/CD14的表達(dá)率，并分析各組之間的差異。采用Spearman相關(guān)檢驗(yàn)分析慢性HCV患者CLEC4M/CD14的表達(dá)率與臨床指標(biāo)的相關(guān)性。
　　2．構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)CLEC4M的Huh7.5細(xì)胞系從 CD14+細(xì)胞中克隆cCLEC4M基因，成功

7、構(gòu)建 GV166-CLEC4M慢病毒表達(dá)載體，脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，利用獲得的慢病毒液轉(zhuǎn)染Huh7.5細(xì)胞，獲得穩(wěn)定過表達(dá)CLEC4M的Huh7.5細(xì)胞系，并利用Western Blot和RT-PCR檢測(cè)CLEC4M的過表達(dá)情況。
　　3．HCV體外培養(yǎng)系統(tǒng)的構(gòu)建使用本室保存的包含 HCV全長(zhǎng)序列的質(zhì)粒pFL-J6/JFH，經(jīng)過酶切線性、DNA純化及T7體外轉(zhuǎn)錄等步驟，獲得全長(zhǎng)HCV轉(zhuǎn)錄本。然后利用DMRIE-C轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染H

8、uh-7.5細(xì)胞，收集HCVcc的病毒液并進(jìn)行感染性檢測(cè)。
　　4．C型凝集素CLEC4M對(duì)HCVcc易感性的影響利用已經(jīng)制備好的具有高感染效率的HCVcc病毒液感染穩(wěn)定過表達(dá)CLEC4M的Huh7.5細(xì)胞系，并設(shè)置單克隆抗體干擾組、甘露聚糖感染組和空白對(duì)照組。采用免疫熒光檢測(cè)和RT-PCR法檢測(cè) CLEC4M對(duì)HCVcc感染效率的影響。
　　5．樹突狀細(xì)胞的體外培養(yǎng)鑒定及CLEC4M分子的鑒定預(yù)先提取健康志愿者外周血PBM

9、Cs，利用CD14免疫磁珠分選技術(shù)分離 CD14+單核細(xì)胞，利用rhGM-CSF和rhIL-4刺激PBMC向DC方向分化，培養(yǎng)第5d加入TNF-α，刺激DC細(xì)胞的成熟。利用流式細(xì)胞儀分別檢測(cè) CD14+的分離效率，及 CLEC4M在CD14+細(xì)胞的表達(dá)率。通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)DC的表面標(biāo)志分子CD83和CD86的表達(dá)率，鑒定DC細(xì)胞的成熟，同時(shí)檢測(cè)成熟DC細(xì)胞CLEC4M的表達(dá)。
　　6．CLEC4M介導(dǎo)DC負(fù)載HCVcc后，免疫應(yīng)

10、答水平的變化應(yīng)用CLEC4M單克隆阻斷抗體阻斷DC表面CLEC4M的表達(dá)后，再用提前制備好的HCVcc病毒液感染DC，設(shè)置甘露聚糖干擾組、空白對(duì)照組。分別收集感染各組的細(xì)胞上清液，采用ELISA法檢測(cè)IL-12p70、IL-10的表達(dá)變化。
　　結(jié)論：
　　1．CLEC4M參與了HCV的感染過程。檢測(cè)了慢性HCV感染者外周血PBMC中CLEC4M/CD14的表達(dá)率，HCV初治患者中CLEC4M/CD14明顯高于健康對(duì)照組、E

11、VR組和SVR組，健康對(duì)照組、EVR組及SVR組各組表達(dá)率無顯著性差異，表明CLEC4M參與了HCV的感染過程并誘導(dǎo)了機(jī)體的免疫應(yīng)答從而損傷了肝臟組織，加速疾病的進(jìn)展。
　　2．構(gòu)建了穩(wěn)定過表達(dá)CLEC4M的Huh7.5細(xì)胞。應(yīng)用HCV細(xì)胞體外培養(yǎng)系統(tǒng)（HCVcc）感染過表達(dá) CLEC4M的 Huh7.5細(xì)胞，提高了HCVcc的易感性，說明CLEC4M可能參與了HCV的入胞過程。
　　3．誘導(dǎo)成熟DC的培養(yǎng)后，檢測(cè)CLEC4