應(yīng)用生物測定法研究重組水蛭素自家兔尿、膽汁的排泄及其藥代動力學(xué).pdf

1、目的： 首次建立一種生物測定法以測定家兔尿和膽汁中重組水蛭素(r-hirudin，rH)，并進(jìn)而研究其藥動學(xué)和排泄機(jī)制，為rH的新藥開發(fā)及臨床合理用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法： 1.家兔尿液、膽汁rH濃度的測定采用凝血酶時間(TT)法測定rH在尿、膽汁中的濃度，該法依據(jù)rH的抗凝血酶活性，選擇凝血酶時間(thrombin time,TT)為其活性指標(biāo)，以logTT延長率對rH濃度作圖制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線計算

2、rH尿液、膽汁濃度。具體方法如下：依次在血凝儀測定杯中加入待測尿液或膽汁10μL、空白兔血漿40μL，0.1 mol/L pH 7.4 Tris-HCl緩沖液和5u/ml的凝血酶溶液各50μL，加入凝血酶溶液的同時血凝儀開始自動記錄凝血時間。 2.方法學(xué)驗(yàn)證 精密度、回收率和線性范圍：日間精密度、日內(nèi)精密度、方法回收率、最低定量限和標(biāo)準(zhǔn)范圍按常規(guī)方法進(jìn)行測定。尿液的稀釋回收率：配制一系列已知濃度rH標(biāo)準(zhǔn)尿液樣品(濃度記為

3、C0)，用兔空白尿液經(jīng)過不同倍數(shù)的稀釋(倍數(shù)記為N)，使稀釋后的濃度在線性范圍以內(nèi)，再用上述測定方法測定得稀釋濃度，記為Cd。稀釋回收率(％)=Cd×N/C0×100。穩(wěn)定性考察：配制高、低(1.67、0.74μg/ml)兩種濃度的rH尿液和膽汁標(biāo)準(zhǔn)溶液，即刻測其濃度，其余樣品分裝數(shù)份分別于-20℃和室溫保存，不同時間測定其濃度，以考察其冰凍保存和室溫保存的穩(wěn)定性。 3.藥代動力學(xué)研究雄性大耳白兔15只，隨機(jī)勻分為三組，iv烏拉

4、坦(25％，4ml/kg)麻醉后，腹腔手術(shù)切開，行雙側(cè)輸尿管和膽總管插管，另從一側(cè)耳緣靜脈恒速滴注生理鹽水0.5ml/min，以維持恒定的尿流量。rH以無菌生理鹽水溶解使成1.0mg/ml溶液，自耳緣靜脈注射給藥，三組動物劑量分別為2.0mg/kg、1.0mg/kg和0.5mg/kg，各動物均于給藥前及給藥后10、20、30、40、60、90、120、180、240、360min分別自相應(yīng)插管收集尿液和膽汁，并同時于給藥前和給藥后5、1

5、5、25、35、50、75、105、150、210、300min(集尿期中點(diǎn)時間)自耳緣靜脈收集血樣(血樣與3.8％枸櫞酸鈉按9：1體積比抗凝)，3000r/min × 15min離心，分離得血漿樣品。按上述方法分別測定尿、膽汁和血中rH濃度，經(jīng)3P97程序處理擬合房室模型，并計算藥代動力學(xué)參數(shù)。 4 家兔血漿rH濃度的測定按照筆者曾報道的生物測定法(TT法)測定。 5 血肌酐和尿肌酐濃度應(yīng)用苦味酸法測定，并由此計算肌酐

6、清除率CLCR。 結(jié)果： 1.方法學(xué)驗(yàn)證TT延長率經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換與尿液和膽汁中rH濃度呈線性相關(guān)(r>0.99)，線性范圍0.49～2.50μg/ml， rH日內(nèi)及日間精密度(RSD)均小于10％，方法回收率大于95％，尿液稀釋回收大于91.9％，-20℃保存至少半月穩(wěn)定，室溫保存至少8h穩(wěn)定。 2.藥代動力學(xué)特征測得家兔尿6h累積排泄量為給藥劑量的60％左右，各時間段收集的膽汁樣品，均未測出rH。尿藥數(shù)據(jù)用虧量法解

7、析，其log(Xu∞-Xut)-t作圖符合靜注二室模型，求得rH的消除半衰期為58.08～63.97min，尿排泄速率常數(shù)為0.022～0.032min-1，MRT為65.59～75.37 min；血藥濃度時間曲線亦為靜注二室模型，其消除半衰期為59.76～62.71 min，MRT為70.4～71.39min，與尿藥數(shù)據(jù)無顯著差別。又算得總體清除率(CLt)為2.80～2.98ml/min/kg，rH的腎清除率(CLR)為1.67～1

8、.78ml/min/kg，CLCR為3.18～4.52ml/min/kg，重吸收率Ra為47.20～61.28％。 結(jié)論： 1.本文建立的TT法符合尿和膽汁排泄動力學(xué)研究要求，尿藥排泄數(shù)據(jù)計算得t1/2、MRT與血藥濃度數(shù)據(jù)結(jié)果基本一致，均表明rH消除快速。 2.血尿數(shù)據(jù)均表明rH在本研究的劑量范圍內(nèi)呈線性動力學(xué)，CLR為CLt的60％左右，膽汁中rH未測得，說明約40％rH在體內(nèi)通過非腎非膽汁途徑清除;CLR<