CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α在香煙煙霧提取物刺激人氣道平滑肌細(xì)胞細(xì)胞增殖中的作用機(jī)制.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)部分展開(kāi)論述：
　　第一部分香煙提取物抑制人氣道平滑肌細(xì)胞CEBPα表達(dá)而促進(jìn)了細(xì)胞增殖
　　目的:
　　在本研究中以不同濃度CSE刺激下體外培養(yǎng)人ASMCs，了解ASMCs的增殖情況以及相應(yīng)的CEBPα的表達(dá)，探討CEBPα在CSE促進(jìn)了ASMCs的增殖中的作用。
　　方法:
　　（一）、制備不同濃度的香煙提取物。
　?。ǘ?、采用siRNA技術(shù)轉(zhuǎn)染相應(yīng)的陰性對(duì)照siRNA、CEB

2、PαsiRNA。
　　（三）、分組。
　　按照不同CSE的濃度分組:2.5％CSE組、5％CSE組、10％CSE組、15％CSE組、20％ CSE組、對(duì)照組，比較各組間人ASMCs的增殖程度及CEBPα表達(dá)。
　　（四）、MTT比色法分析人ASMCs的增殖程度（吸光度值OD490nm表示）。
　?。ㄎ澹?、采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)人ASMCs中CEBPα的mRNA水平。
　?。⒉捎妹庖?/p>

3、印跡法（Western blot法）檢測(cè)人ASMCs中CEBPα的表達(dá)。
　?。ㄆ撸?、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:使用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
　　結(jié)果:
　?。ㄒ唬?、不同CSE濃度作用下人ASMCs的增殖程度:
　　在2.5～10％CSE作用下，隨著CSE濃度的增高人ASMCs的增殖程度逐漸增加，在10％CSE作用下達(dá)到峰值，之后15％CSE、20％CSE濃度作用下細(xì)胞增殖程度出現(xiàn)下降趨勢(shì)。推測(cè)高于10％的CSE

4、可能存在直接細(xì)胞毒性作用，抑制了細(xì)胞增殖，故選取2.5～10％CSE作為后續(xù)試驗(yàn)刺激濃度。
　?。ǘ?、不同CSE濃度下人ASMCs的CEBPα的表達(dá)。
　　隨著CSE濃度的遞增，CEBPα蛋白表達(dá)逐漸減少，但CEBPαmRNA表達(dá)無(wú)差異。
　?。ㄈ?、在10％CSE作用下，CEBPαsiRNA組、陰性對(duì)照siRNA組人ASMCs中CEBPα表達(dá)及細(xì)胞增殖程度的比較。
　　采用siRNA技術(shù)抑制人ASMCs中CE

5、BPα的表達(dá)后，細(xì)胞增殖程度反而增加。
　　結(jié)論:
　　本研究發(fā)現(xiàn)，在香煙提取物作用下，氣道平滑肌細(xì)胞下CEBPα蛋白表達(dá)受抑制，相應(yīng)的促進(jìn)了細(xì)胞增殖。而這種CEBPα的蛋白的表達(dá)受抑制主要是受轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的。在采用siRNA技術(shù)抑制CEBPα的蛋白表達(dá)后，人ASMCs的增殖反而增加，說(shuō)明CEBPα在氣道平滑肌中扮演著抗細(xì)胞增殖作用。
　　第二部分香煙提取物對(duì)人氣道平滑肌細(xì)胞增殖中鈣網(wǎng)織蛋白及CEBPα表達(dá)的影響

6、　　目的:
　　在本研究中以不同濃度香煙提取物刺激下體外培養(yǎng)人氣道平滑肌細(xì)胞，了解抑制細(xì)胞增殖的重要因子CEBPα和其上游調(diào)控因子——鈣網(wǎng)織蛋白的表達(dá)，探討CEBPα上游調(diào)節(jié)因子鈣網(wǎng)織蛋白在香煙提取物促進(jìn)氣道平滑肌細(xì)胞增殖中發(fā)揮的作用。
　　方法:
　　（一）、制備不同濃度的香煙提取物。
　?。ǘ?、采用siRNA技術(shù)轉(zhuǎn)染相應(yīng)的鈣網(wǎng)織蛋白siRNA及陰性對(duì)照siRNA至人氣道平滑肌細(xì)胞。
　?。ㄈ?、分組<

7、br>　　1、按照不同CSE的濃度分組:2.5％ CSE組、5％CSE組、10％CSE組、15％CSE組、20％ CSE組、對(duì)照組，比較各組間ASMCs的增殖程度及CEBPα表達(dá)。
　　2、在10％CSE濃度條件下，進(jìn)一步通過(guò)分別對(duì)ASMCs轉(zhuǎn)染鈣網(wǎng)織蛋白siRNA及陰性對(duì)照siRNA相應(yīng)分為鈣網(wǎng)織蛋白siRNA組及陰性對(duì)照siRNA組。比較兩組ASMCs的CEBPα、鈣網(wǎng)織蛋白的表達(dá)及細(xì)胞增殖程度的差異。
　?。ㄋ模?、以M

8、TT比色法分析各組人ASMCs的增殖程度（吸光度值OD490nm表示）。
　　（五）、采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)各組人ASMCs中CEBPα的mRNA水平。
　?。⒉捎妹庖哂≯E法（Western blot法）檢測(cè)各組人ASMCs中CEBPα、鈣網(wǎng)織蛋白的表達(dá)。
　?。ㄆ撸?、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:使用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所有計(jì)量資料以(x)± s表示。多組間比較采用單因素方差分析，方差齊性時(shí)

9、多重比較采用LSD法，方差不齊采用DuunettT3法。兩獨(dú)立樣本計(jì)量資料比較t檢驗(yàn)。P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　?。ㄒ唬⒉煌珻SE濃度作用下人ASMCs的增殖程度:
　　高于10％的CSE可能存在直接細(xì)胞毒性作用，抑制了細(xì)胞增殖，故選取2.5～10％CSE作為后續(xù)試驗(yàn)刺激濃度。
　?。ǘ?、不同CSE濃度下人ASMCs的CEBPα的表達(dá)。
　　隨著CSE濃度的遞增，CEBPα蛋白表達(dá)逐漸

10、減弱，但CEBPαmRNA表達(dá)無(wú)差異。
　?。ㄈ?、不同CSE濃度下人ASMCs中鈣網(wǎng)織蛋白表達(dá)。
　　隨著CSE濃度的遞增，鈣網(wǎng)織蛋白的表達(dá)逐漸增加。
　?。ㄋ模?、在10％CSE作用下，鈣網(wǎng)織蛋白siRNA組、陰性對(duì)照siRNA組人ASMCs中鈣網(wǎng)織蛋白、CEBPα表達(dá)、細(xì)胞增殖程度的比較。
　　在10％CSE條件下，鈣網(wǎng)織蛋白siRNA組較陰性對(duì)照siRNA組中鈣網(wǎng)織蛋白表達(dá)減弱，但CEBPα表達(dá)增強(qiáng)，而相應(yīng)

11、地細(xì)胞增殖程度減弱。
　　結(jié)論:
　　本研究發(fā)現(xiàn)，一定濃度CSE作用下，人氣道平滑肌細(xì)胞中鈣網(wǎng)織蛋白的表達(dá)隨著CSE濃度增加而增強(qiáng)，而CEBPα的蛋白表達(dá)隨著CSE濃度增加而減弱。采用siRNA技術(shù)抑制鈣網(wǎng)織蛋白表達(dá)后，反而CEBPα蛋白表達(dá)增強(qiáng)，繼而氣道平滑肌細(xì)胞增殖減弱。說(shuō)明在一定濃度CSE作用下ASMCs中CEBPα的蛋白表達(dá)受抑制是受鈣網(wǎng)織蛋白調(diào)控的，進(jìn)而影響了ASMCs的增殖。
　　第三部分香煙提取物通過(guò)CE

12、BPα調(diào)控細(xì)胞周期促進(jìn)了人氣道平滑肌細(xì)胞增殖
　　目的:
　　在本研究中以不同濃度香煙提取物作用于體外培養(yǎng)人ASMCs，了解人ASMCs中抑制細(xì)胞增殖的重要因子CEBPα以及細(xì)胞周期重要限速酶CDK2、CDK4的表達(dá)變化，并分析細(xì)胞周期各期比例變化，另外，采用siRNA技術(shù)抑制CEBPα的表達(dá)后CDK2、CDK4的表達(dá)及細(xì)胞周期各期比例的變化，從而探討在香煙提取物作用下CEBPα是否通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期的分布而發(fā)揮其抑制細(xì)胞增殖

13、的作用。
　　方法:
　　（一）、制備不同濃度的香煙提取物。
　　（二）、采用siRNA技術(shù)轉(zhuǎn)染相應(yīng)的CEBPαsiRNA、陰性對(duì)照siRNA。
　?。ㄈ⒎纸M
　　1、按照不同CSE的濃度分組:2.5％ CSE組、5％CSE組、10％CSE組、15％CSE組、20％CSE組及對(duì)照組，比較各組間人ASMCs的增殖程度及CEBPα表達(dá)。
　　2、在10％CSE濃度條件下，進(jìn)一步通過(guò)分別對(duì)人ASMCs轉(zhuǎn)

14、染CEBPαsiRNA、陰性對(duì)照siRNA相應(yīng)分為CEBPαsiRNA組、陰性對(duì)照siRNA組。比較兩組人ASMCs的CEBPα表達(dá)、細(xì)胞周期分布及增殖程度的差異。
　?。ㄋ模⒁訫TT比色法分析人ASMCs的增殖程度（吸光度值OD490nm表示）。
　?。ㄎ澹?、采用免疫印跡法(Western blot法）檢測(cè)人ASMCs中CEBPα、CDK2及CDK4的表達(dá)。
　　（六）、流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期測(cè)定，計(jì)算各組人ASM

15、Cs中G0/G1期細(xì)胞比例、S期、G2/M期細(xì)胞比例。
　　（七）、使用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所有計(jì)量資料以(x)±s表示。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，方差齊性時(shí)多重比較采用LSD法，方差不齊采用DuunettT3法。兩獨(dú)立樣本均數(shù)計(jì)量資料比較t檢驗(yàn)。P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　?。ㄒ唬?、不同CSE濃度下人ASMCs的增殖程度
　　高于10％的CSE可能存在直接細(xì)胞毒性作用，

16、故選取2.5～10％CSE作為后續(xù)試驗(yàn)刺激濃度。
　　（二）、2.5～10％CSE濃度下人ASMCs的CEBPα的表達(dá)
　　隨著CSE濃度的遞增，CEBPα蛋白表達(dá)逐漸減弱。
　　（三）、2.5～10％CSE濃度下人ASMCs的CDK2、CDK4的表達(dá)
　　隨著CSE濃度的遞增，CDK2、CDK4的表達(dá)均逐漸增加。
　?。ㄋ模?.5～10％CSE濃度下人ASMCs中G0/G1、S期、G2/M期細(xì)胞比例(％

17、)的比較。
　　隨著CSE濃度的遞增，G0/G1期細(xì)胞比例遞減，S期細(xì)胞比例遞增，G2/M期細(xì)胞無(wú)顯著變化。
　?。ㄎ澹⒃?0％CSE作用下，CEBPαsiRNA組、陰性對(duì)照siRNA組中CEBPα表達(dá)、細(xì)胞增殖程度及細(xì)胞周期分布的比較。
　　在10％CSE作用下，CEBPαsiRNA組較陰性對(duì)照siRNA組ASMCs中CEBPα表達(dá)減弱，而CDK2、CDK4表達(dá)增強(qiáng)，進(jìn)而細(xì)胞周期中G0/G1期細(xì)胞比例顯著減少，同時(shí)