IgA腎病人腭扁桃體單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)上清對(duì)人腎小管上皮細(xì)胞株(HK-2)超氧陰離子型活性氧調(diào)控及凋亡影響.pdf

1、IgA腎病(IgAN，IgAnephropathy)又稱Berger's病，是一組以腎小球系膜區(qū)IgA沉積，同時(shí)伴系膜細(xì)胞增生和系膜基質(zhì)擴(kuò)張為主要病理改變的原發(fā)性腎小球腎炎。IgAN臨床表現(xiàn)多樣，即可表現(xiàn)為無(wú)癥狀性血尿或蛋白尿，也可表現(xiàn)為急，慢性腎衰竭等嚴(yán)重腎臟受損表現(xiàn)。與臨床表現(xiàn)的多樣性相似，IgA腎病患者腎組織病理改變也多種多樣。IgA腎病是目前全球范圍內(nèi)最常見的一種原發(fā)性腎小球腎炎，我國(guó)是IgA腎病的高發(fā)地區(qū)，據(jù)報(bào)道IgA腎病占腎

2、活檢患者的39.55％。以往認(rèn)為IgA腎病預(yù)后良好，但大量臨床研究顯示在10-20年內(nèi)10％-20％患者將不可避免地持續(xù)進(jìn)展至ESRD。如何預(yù)防和治療IgA腎病是腎內(nèi)科醫(yī)生不容回避的一個(gè)問題。
　　腭扁桃體粘膜免疫與IgAN腎臟損傷存在密切的關(guān)系。IgAN患者尿檢惡化常常在上呼吸道感染后發(fā)生。扁桃體切除聯(lián)合激素沖擊治療較單純激素沖擊治療明顯改善患者血尿和蛋白尿，減少腎臟系膜區(qū)IgA沉積和系膜區(qū)增生，保護(hù)腎功能。多項(xiàng)研究證明，IgA

3、N患者扁桃體存在多方面的異常:在結(jié)構(gòu)上，扁桃體隱窩上皮異常網(wǎng)狀化;在受到外界抗原刺激后，IgAN患者扁桃體存在過強(qiáng)的免疫反應(yīng)，不僅有免疫細(xì)胞種類失衡，且分泌產(chǎn)物異常。如受到副流感嗜血桿菌等的刺激后，研究者發(fā)現(xiàn)扁桃體T淋巴細(xì)胞聚集的小區(qū)和主要由小T淋巴細(xì)胞構(gòu)成的小結(jié)節(jié)增大，扁桃體免疫調(diào)節(jié)功能過度活化，導(dǎo)致B細(xì)胞過度刺激，濾泡外增殖，分泌多聚IgA的扁桃體淋巴細(xì)胞增加。這種絞鏈區(qū)低糖基化的IgA分子與系膜區(qū)沉積的IgA分子特征相同，為扁桃體

4、與腎臟系膜損傷之間的關(guān)系提供了依據(jù)。
　　IgAN患者的腭扁桃體單個(gè)核細(xì)胞(TonsillarMononuclearCells,TMCs)分泌產(chǎn)物的異常已被多項(xiàng)研究證實(shí)。在外來(lái)抗原如副流感嗜血桿菌抗原(OMHP)等刺激后，IgAN患者TMCs對(duì)抗原的刺激反應(yīng)過強(qiáng)，分泌如TGF-β，IL-10，IFN-γ等細(xì)胞因子增加，刺激B細(xì)胞過度增殖，產(chǎn)生更多的生產(chǎn)IgA的漿細(xì)胞。
　　活性氧是指機(jī)體內(nèi)由氧形成的，含氧且化學(xué)性質(zhì)活潑的物質(zhì)

5、的總稱，最主要的有兩種含氧的自由基:超氧陰離子和羥自由基。過多的活性氧可以通過氧化DNA，蛋白質(zhì)，多元不飽和脂肪酸，尤其是脂質(zhì)的過氧化造成生物損傷。現(xiàn)代研究顯示，包括IgAN在內(nèi)的多種疾病與活性氧損傷有關(guān)。通過對(duì)IgAN患者腎活檢標(biāo)本和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明IgAN腎內(nèi)活性氧-腎素-血管緊張素軸在腎臟損傷早期階段已激活并且在腎臟損傷方面發(fā)揮作用。腭扁桃體單個(gè)核細(xì)胞分泌產(chǎn)物是否造成腎小管上皮細(xì)胞活性氧水平增加和氧化應(yīng)激反應(yīng)，損傷腎小管上皮細(xì)胞目

6、前缺乏報(bào)道。我們的研究收集IgAN患者和非腎炎慢性扁桃體炎患者(ChronicTonsillitis，CT)手術(shù)切除的右側(cè)腭扁桃體，分離TMCs培養(yǎng)，收集培養(yǎng)上清液作用于人腎小管上皮細(xì)胞株(HK-2)，測(cè)定其超氧陰離子型活性氧水平的同時(shí)觀察HK-2細(xì)胞凋亡水平及凋亡相關(guān)因子bcl-2，進(jìn)一步觀察TGF-β1對(duì)人腎小管上皮細(xì)胞株(HK-2)超氧陰離子型活性氧水平和凋亡的影響，從而探索扁桃體影響腎小管上皮細(xì)胞的途徑，為進(jìn)一步研究保護(hù)腎小管上

7、皮細(xì)胞的策略打下基礎(chǔ)。本研究共分為三部分。
　　第一部分IgAN人TMCs培養(yǎng)上清對(duì)人腎小管上皮細(xì)胞株(HK-2)超氧陰離子型活性氧的調(diào)控及凋亡的影響
　　目的：
　　觀察IgA腎病人TMCs培養(yǎng)上清對(duì)體外培養(yǎng)的人腎小管上皮細(xì)胞株(HK-2)超氧陰離子型活性氧水平及凋亡的影響，探討IgA腎病TMCs上清是否可通過超氧陰離子型活性氧損傷腎小管上皮細(xì)胞，造成小管上皮細(xì)胞凋亡。
　　方法：
　　一、IgAN和非腎

8、炎CT患者TMCs培養(yǎng)上清對(duì)人腎小管上皮細(xì)胞株(HK-2)超氧陰離子型活性氧水平的影響:
　　分別收集10例IgAN和非腎炎慢性扁桃體炎患者(chronictonsillitis，CT)手術(shù)摘除的右側(cè)腭扁桃體，分離TMCs，分成四組進(jìn)行培養(yǎng):
　　1.IgAN+組:IgAN患者TMCs加入PHA（10μg/mL）培養(yǎng)72hr;
　　2.IgAN-組:IgAN患者TMCs不加PHA培養(yǎng)72hr;
　　3.非腎炎CT

9、+組:CT患者TMCs加入PHA(10μg/mL)培養(yǎng)72hr;
　　4.非腎炎CT-組:CT患者TMCs不加PHA培養(yǎng)72hr。
　　體外培養(yǎng)72小時(shí)后，收集四組TMCs培養(yǎng)上清液，按20％的濃度加入人腎小管上皮細(xì)胞株（HK-2）培養(yǎng)12hr，同時(shí)設(shè)置HK-2細(xì)胞的0.5％胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)組作為陰性對(duì)照組（Con組），用流式細(xì)胞儀測(cè)定各組HK-2細(xì)胞二氫乙啶(DHE)（反映活性氧，尤其是超氧陰離子型活性氧水平）熒

10、光強(qiáng)度。
　　二、IgAN+TMCs培養(yǎng)上清對(duì)HK-2細(xì)胞凋亡的影響以及與超氧陰離子型活性氧的關(guān)系:
　　IgAN患者TMCs加入PHA（1Oμg/mL）培養(yǎng)72小時(shí)，收集上清液。將HK-2細(xì)胞分成三組:
　　1.陰性對(duì)照組:0.5％胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)HK-2細(xì)胞;
　　2.IgAN+組:20％PHA刺激的IgANTMCs上清液培養(yǎng)HK-2細(xì)胞24hr;
　　3.IgAN+&SOD組:20％PHA刺

11、激的IgANTMCs上清液與Cu/ZnSOD(100units/mL)共同加入HK-2細(xì)胞培養(yǎng)24hr。
　　用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組HK-2細(xì)胞AnnexinV，PropidiumIodide（反映凋亡水平）熒光強(qiáng)度，臺(tái)酚藍(lán)染色測(cè)定活細(xì)胞數(shù)，計(jì)算細(xì)胞存活率。
　　結(jié)果：
　　一、IgAN和非腎炎CT患者TMCs培養(yǎng)上清對(duì)腎小管上皮細(xì)胞株(HK-2)超氧陰離子型活性氧水平的影響:
　　對(duì)比于陰性對(duì)照組（Con組）DH

12、E水平（100±0），IgAN+組HK-2細(xì)胞DHE水平為194.06±16.75，IgAN-組HK-2細(xì)胞DHE水平為166.72±10.24，非腎炎CT+組HK-2細(xì)胞DHE水平為111.23±14.64，非腎炎CT-組HK-2細(xì)胞DHE水平為104.18±11.25。IgAN+組HK-2細(xì)胞DHE水平較陰性對(duì)照組（Con組），IgAN+組，非腎炎CT+組，非腎炎CT-組高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)。IgAN-組較Con組

13、，非腎炎CT+組，非腎炎CT-組HK-2細(xì)胞DHE水平高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)。
　　二、IgAN+TMCs培養(yǎng)上清對(duì)HK-2細(xì)胞凋亡的影響以及與超氧陰離子型活性氧的關(guān)系:
　　IgAN+組HK-2細(xì)胞凋亡率27.66％±5.50％，較陰性對(duì)照組(Con組)HK-2細(xì)胞凋亡率(11.08％±2.35％)高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)。IgAN+&SOD組HK-2細(xì)胞凋亡率16.33％±4.49％，較Ig

14、AN+組低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)，較Con組高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)。
　　直接用臺(tái)酚藍(lán)檢測(cè)活細(xì)胞計(jì)數(shù)的辦法統(tǒng)計(jì)細(xì)胞存活率得出:IgAN+組TMCs培養(yǎng)上清加入HK-2細(xì)胞共培養(yǎng)24hr后較對(duì)照組能減少其細(xì)胞存活率(71.8％±4.65％vs97％±.33％)(p＜0.01)，加入SOD的IgAN+&SOD組（83.7％±3.84％）較IgAN+組能增加細(xì)胞存活率(p＜0.01)。
　　結(jié)論：

15、r>　　1.PHA刺激和未刺激的IgAN患者TMCs培養(yǎng)上清液與HK-2細(xì)胞共培養(yǎng)后能增加HK-2細(xì)胞超氧陰離子型活性氧水平;
　　2.PHA刺激的IgAN患者的TMCs培養(yǎng)上清液增加HK-2細(xì)胞凋亡率，抑制超氧負(fù)離子型活性氧能部分減輕IgANTMCs培養(yǎng)上清對(duì)HK-2細(xì)胞凋亡的影響。
　　第二部分IgAN人TMCs培養(yǎng)上清對(duì)人腎小管上皮細(xì)胞株(HK-2)超氧陰離子型活性氧調(diào)控的時(shí)間規(guī)律及對(duì)bcl-2，p53的調(diào)控
　

16、　目的：
　　觀察IgAN人TMCs培養(yǎng)上清與人腎小管上皮細(xì)胞株(HK-2)共培養(yǎng)后超氧陰離子型活性氧水平的時(shí)間變化規(guī)律以及人腎小管上皮細(xì)胞株(HK-2)bcl-2，p53水平變化與超氧陰離子型活性氧的關(guān)系。
　　方法：
　　一、IgAN人TMCs培養(yǎng)上清對(duì)HK-2細(xì)胞超氧陰離子型活性氧調(diào)控的時(shí)間規(guī)律:
　　IgAN人TMCs加入PHA(10μg/mL)培養(yǎng)72hr，收集上清液，按20％濃度加入腎小管上皮細(xì)胞株(

17、HK-2)。分別在加入上清液0hr，1hr，3hr，6hr和12hr流式細(xì)胞儀測(cè)定HK-2細(xì)胞DHE熒光強(qiáng)度。
　　二、IgAN人TMCs培養(yǎng)上清對(duì)HK-2細(xì)胞bcl-2，p53的調(diào)控及與超氧陰離子型活性氧關(guān)系:
　　2.1IgAN人TMCs培養(yǎng)上清對(duì)HK-2細(xì)胞bcl-2，p53的調(diào)控:
　　IgAN人TMCs加入PHA（10μg/mL）培養(yǎng)72hr，收集上清液，按20％濃度加入腎小管上皮細(xì)胞株（HK-2）。分別在加

18、入上清液培養(yǎng)0hr，3hr和12hr提取HK-2細(xì)胞總蛋白，westernblotting測(cè)定bcl-2和p53蛋白水平。
　　2.2超氧陰離子型活性氧對(duì)HK-2細(xì)胞bcl-2，p53調(diào)控:
　　將人腎小管上皮細(xì)胞株(HK-2)分成三組:
　　1.陰性對(duì)照組:HK-2細(xì)胞加入0.5％胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng);
　　2.IgAN+組:PHA(10μg/mL)刺激的IgANTMCs培養(yǎng)上清按20％濃度加入培基與HK

19、-2細(xì)胞共培養(yǎng);
　　3.IgAN+&SOD組:PHA刺激的IgANTMCs培養(yǎng)上清20％與Cu/ZnSOD(100units/mL)一起加入HK-2細(xì)胞培養(yǎng)。
　　各組HK-2細(xì)胞培養(yǎng)12hr提取總蛋白，WesternBlotting測(cè)bcl-2，p53蛋白水平。
　　結(jié)果：
　　一、IgAN人TMCs培養(yǎng)上清對(duì)HK-2細(xì)胞超氧陰離子型活性氧調(diào)控的時(shí)間規(guī)律:
　　PHA刺激的IgAN人TMCs上清在加入H

20、K-2細(xì)胞0-3hr內(nèi)HK-2細(xì)胞的DHE水平逐漸增加，3hrDHE水平增加到最高(290.48±43.94)，（與其他各組比p＜0.01），之后逐漸下降，培養(yǎng)12hrHK-2細(xì)胞活性氧水平降到3hr的55％（150.39±43）。
　　二、IgAN人TMCs培養(yǎng)上清對(duì)HK-2細(xì)胞bcl-2，p53的調(diào)控及與超氧陰離子型活性氧關(guān)系:
　　PHA刺激的IgAN人TMCs培養(yǎng)上清液加入HK-2細(xì)胞3hrHK-2細(xì)胞bcl-2較0

21、hr無(wú)變化，12hrbcl-2蛋白明顯減少;加入SOD能減輕IgAN人TMCs上清對(duì)bcl-2的負(fù)調(diào)節(jié)。p53在整個(gè)過程中無(wú)明顯變化。
　　結(jié)論：
　　1.PHA刺激的IgAN人TMCs培養(yǎng)上清液作用于HK-2細(xì)胞0-3hr內(nèi)HK-2細(xì)胞超氧陰離子型活性氧水平逐漸增加，加入上清液后3hr達(dá)到最高，3hr后隨時(shí)間增加下降;
　　2.PHA刺激的IgAN人TMCs培養(yǎng)上清液作用于HK-2細(xì)胞3hrHK-2細(xì)胞bcl-2水平

22、無(wú)明顯變化，作用12hrbcl-2明顯減少，加入SOD抑制超氧陰離子型活性氧能明顯減輕IgAN人TMCs上清對(duì)bcl-2的負(fù)調(diào)節(jié);
　　3.PHA刺激的IgAN人TMCs上清液作用于HK-2細(xì)胞0-12hrHK-2細(xì)胞p53無(wú)明顯變化，加入SOD亦不能明顯改變p53。
　　第三部分IgAN人TMCs培養(yǎng)上清與人腎小管上皮細(xì)胞株(HK-2)共培養(yǎng)上清TGF-β1蛋白表達(dá)及外源性TGF-β1對(duì)HK-2超氧陰離子型活性氧及凋亡影響

23、
　　目的：
　　觀察PHA刺激的IgAN人TMCs培養(yǎng)上清液作用于HK-2細(xì)胞后共培養(yǎng)上清液TGF-β1的水平變化以及對(duì)比于IgAN患者TMCs上清液，外源性TGF-β1對(duì)HK-2細(xì)胞超氧負(fù)離子型活性氧水平及細(xì)胞凋亡的調(diào)控。
　　方法：
　　一、IgAN人TMCs培養(yǎng)上清與人腎小管上皮細(xì)胞株(HK-2)共培養(yǎng)上清液TGF-β1的水平變化:
　　將人腎小管上皮細(xì)胞株（HK-2）分成三組:
　　1.陰性

24、對(duì)照組:加入0.5％胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24hr;
　　2.IgAN+組:加入20％PHA刺激的IgANTMCs培養(yǎng)上清液培養(yǎng)24hr;
　　3.非腎炎CT+組:加入20％PHA刺激后的非腎炎CTTMCs養(yǎng)上清液共培養(yǎng)24hr。
　　用ELISA雙抗體夾心法測(cè)定各組HK-2細(xì)胞共培養(yǎng)上清液的TGF-β1水平。
　　二、外源性TGF——β1對(duì)人腎小管上皮細(xì)胞株(HK-2)超氧陰離子型活性氧及細(xì)胞凋亡的影

25、響:
　　將HK-2細(xì)胞分成四組:
　　1.陰性對(duì)照組（Con組）:加入0.5％胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)液;
　　2.IgAN+組:加入20％PHA刺激后的IgAN人TMCs培養(yǎng)上清液;
　　3.TGF-β1組:加入TGF-β1(5ng/mL);
　　4.TGF-β1&SOD組:加入TGF-β1(5ng/mL)+SOD(100units/mL)。
　　各組HK-2細(xì)胞培養(yǎng)12hr后用流式細(xì)胞儀測(cè)定D

26、HE熒光強(qiáng)度，各組培養(yǎng)24hr測(cè)定％AnnexinV(+)凋亡水平。
　　結(jié)果：
　　一、IgAN人TMCs培養(yǎng)上清與人腎小管上皮細(xì)胞株(HK-2)共培養(yǎng)上清液TGF-β1的水平變化:
　　陰性對(duì)照組HK-2細(xì)胞培養(yǎng)液TGF-β1為21.76±1.89ng/L，IgAN+組共培養(yǎng)液TGF-β1為1162.76±162.13ng/L，非腎炎CT+組共培養(yǎng)液TGF-β1為314.81±43.79ng/L。IgAN+組與陰性

27、對(duì)照組和非腎炎CT+組比較，共培養(yǎng)液的TGF-β1水平高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)。非腎炎CT+組與陰性對(duì)照組比較，共培養(yǎng)液TGF-β1水平高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)。
　　二、外源性TGF——β1對(duì)人腎小管上皮細(xì)胞株(HK-2)超氧陰離子型活性氧及細(xì)胞凋亡的影響:
　　IgAN+組DHE熒光強(qiáng)度為173.12±8.47，TGF-β1組DHE熒光強(qiáng)度為193.34±20.36，兩組與陰性對(duì)照組比較，HK-2細(xì)胞熒光

28、強(qiáng)度（100±0）強(qiáng)，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)。TGF-β1&SOD組DHE熒光強(qiáng)度為121.4±7.27，較TGF-β1組低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)。
　　TGF-β1組HK-2細(xì)胞凋亡率為30.72％±4.22％，IgAN+組HK-2細(xì)胞凋亡率為36.34％±3.22％，TGF-β1&SOD組HK-2細(xì)胞凋亡率為24.96％±2.56％。TGF-β1組HK-2細(xì)胞凋亡率比陰性對(duì)照組（16.74％±1.25％）高，

29、差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)，比IgAN+組低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。TGF-β1&SOD組細(xì)胞凋亡率比TGF-β1組低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)。
　　結(jié)論：
　　1.PHA刺激的IgAN人TMCs上清液加入HK-2細(xì)胞能增加共培養(yǎng)液的TGF-β1水平;
　　2.外源性TGF-β1加入HK-2細(xì)胞能增加HK-2細(xì)胞超氧陰離子型活性氧水平及凋亡率，TGF-β1介導(dǎo)的HK-2細(xì)胞凋亡能被SOD部分